复合益生菌发酵豆粕的技术参数优化

王国强，王秋文，樊春光，刘超齐，常 娟，尹清强*，王二柱，卢富山(.南阳农业职业学院，河南 南阳 7000； .河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 5000； ．河南德邻生物制品有限公司，河南 新乡5000； ．河南省饲料微生物工程技术研究中心，河南 周口66000)

复合益生菌发酵豆粕的技术参数优化

王国强1，王秋文2，樊春光2，刘超齐2，常 娟2，尹清强2*，王二柱3，卢富山4
(1.南阳农业职业学院，河南 南阳 473000； 2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002； 3．河南德邻生物制品有限公司，河南 新乡453000； 4．河南省饲料微生物工程技术研究中心，河南 周口466000)

为了降低豆粕中抗营养因子的含量，从而使其营养价值得到进一步提高，应用复合益生菌发酵豆粕。利用四因素三水平的正交试验设计，确定豆粕的最佳发酵参数为：异常汉逊酵母菌︰枯草芽孢杆菌︰干酪乳杆菌为2∶2∶1，接种量5%，发酵时间为48 h。在此条件下，豆粕中的抗原蛋白降解彻底，酸溶蛋白含量提高了73.9%，有益活菌总数达到8.5×108cfu/g，明显提高了豆粕的营养价值。

益生菌； 豆粕； 发酵； 技术参数

豆粕是一种优质的植物蛋白饲料，其氨基酸组分均衡，一直是饲料工业和养殖业中重要的蛋白质原料。但豆粕中也含有许多种抗营养因子(胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白、不良寡糖等)，对动物生长发育造成一些负面的影响，尤其对幼龄动物的影响更大[1]。因此，寻找消除豆粕中抗营养因子的方法，是饲料工业和养殖业急需解决的问题。

利用微生物发酵豆粕主要是以豆粕为原料，接种单一或多种微生物，或与一些蛋白酶进行复合，通过微生物的发酵或蛋白酶的酶解作用，可有效地消除或降低豆粕中的抗营养因子，同时还可把大分子大豆蛋白降解为易被动物消化和吸收的小分子多肽类物质和蛋白质。在微生物发酵的过程中，不仅含有大量的益生菌，而且还产生一些维生素、有机酸及未知生长因子等，可以提高饲料的适口性，调节动物胃肠道微生物区系，提高饲料中营养物质特别是蛋白质的消化和利用率，提高动物生产性能，减少腹泻等消化道疾病[2-5]。前人的研究结果表明，利用芽孢杆菌发酵豆粕饲喂仔猪，可显著提高其日增质量和采食量[6]；豆粕经A.usamii发酵后，其中的植酸磷被完全降解[7]；豆粕经米曲霉发酵后，其中的大分子抗原蛋白和胰蛋白酶抑制因子的含量显著降低[8]。可见，发酵豆粕具有较大的潜在价值。为了降低豆粕中的抗营养因子、提高其营养价值，选用枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和异常汉逊酵母，进行高效复合后对豆粕进行微生物发酵，以豆粕中抗原蛋白的降解情况、酸溶蛋白含量及活菌数为判定指标，确定复合微生物发酵豆粕的最佳配合比例和发酵时间以及最适接种量，旨在为发酵豆粕的规模化生产提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

本研究所用的异常汉逊酵母、枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌，购自中国科学院微生物研究所，并由河南农业大学牧医工程学院动物营养与饲料生物技术研究室保存。

1.2 培养基

枯草芽孢杆菌培养选用LB培养基：葡萄糖2%、蛋白胨1.4%、氯化钠0.48%。

异常汉逊酵母培养采用YPD培养基：酵母浸提物1.5%、蛋白胨2%、葡萄糖1.5%。

培养乳酪杆菌选用MRS培养基：胰蛋白胨1.5%、酵母浸出物1.2%、葡萄糖1.5%、磷酸氢二钾0.2%、乙酸钠0.4%、柠檬酸钠0.25%、硫酸镁150 mg/L、硫酸锰55 mg/L，吐温(80)1 mL/L。

发酵豆粕所用培养基：称取豆粕(蛋白质含量为46%)60 g，加入玉米粉1.5 g和葡萄糖1.5 g，调整含水量到45%，置于250 mL的三角瓶中，在0.15 MPa高压条件下，灭菌20 min后备用。

1.3 试验设计

采用四因素三水平的正交试验设计，4个因素分别为：枯草芽孢杆菌、异常汉逊酵母、干酪乳杆菌及微生物发酵时间，分别用A、B、C和D来表示；3种微生物接种量的3个水平分别为：0、1%和2%，发酵时间所选用的3个水平为：24 h、48 h和72 h。根据微生物接种量的多少，采用灭菌的蒸馏水调配，使每个处理组的含水量一致。试验共设置9个处理组，每组3个重复，采用需氧发酵和厌氧发酵相结合的方式于37 ℃进行培养，每4 h翻动一次，发酵至24 h后静置培养。根据设计的时间取样，风干后进行粉碎，过250 μm筛，取筛下来的粉末测定其抗原蛋白的含量、酸溶蛋白的含量以及有益活菌数，以此作为主要的参考指标，确定各菌种的最佳配比、最适接种量和最佳发酵时间。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 抗原蛋白含量 称样品1.0 g，将其浸泡于20 mL的提取液中，在30 ℃摇床上(以100 r/min)浸泡1 h，然后4 000 r/min离心20 min，取上清液，利用SDS-PAGE检测抗原蛋白。其操作流程如下: 将15 μL浸提的豆粕或发酵豆粕样品与15 μL样品缓冲液等量混匀，100 ℃加热3～5 min，放在冷水中冷却，1 000 r/min离心2 min，取15 μL点样，进行电泳。电泳结束后，小心轻柔地从电泳板上将胶脱下，放入盒中，加入约5倍体积的染色液浸泡，放在平缓摇动的平台上室温染色过夜。倒掉染色液，用脱色液冲洗后，将凝胶浸泡于脱色液中，平缓摇动，每3 h换一次脱色液，直至完全脱色。

1.4.2 酸溶蛋白含量 采用QB/T 2653—2004的方法，样品用15%三氯乙酸处理后，通过离心把沉淀的大分子蛋白除去，收集留在上清液中分子质量在10 ku以下的肽类和氨基酸，利用福林(Folin)-酚法，测定上清液中酸溶蛋白含量[9]。

1.4.3 有益活菌总数 用生理盐水将样品稀释到1×10-7～1×10-8，取100 μL的稀释液在含有LB培养基的平皿中涂均匀，在37 ℃下培养48 h后计数。

1.5 数据处理

采用SAS 8.1统计软件对所有数据进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 复合微生物发酵对豆粕中抗原蛋白的降解作用

从图1可以看出，普通豆粕和未经微生物发酵的豆粕具有多个抗原蛋白条带，而经微生物发酵后的豆粕大部分抗原蛋白已消失，大分子质量蛋白(>20 ku)几乎全部降解，说明豆粕经复合微生物发酵后，可明显地降低抗原蛋白的含量，有利于提高豆粕的营养价值。

M为蛋白质Marker； 1—2为未经发酵的豆粕；3—10为复合微生物发酵的豆粕

2.2 复合微生物发酵对豆粕中酸溶蛋白含量的影响

表1的正交试验结果表明，复合益生菌固态发酵豆粕的最优组合为A3B3C2D2，其最佳复合微生物发酵的条件如下：枯草芽孢杆菌∶异常汉逊酵母菌∶干酪乳杆菌=2∶2∶1，微生物总接种量为5%，发酵时间为48 h。在此发酵条件下，发酵豆粕中酸溶蛋白含量达到12.0%，高于未发酵豆粕73.9%。4个因素对酸溶蛋白的影响顺序依次为：枯草芽孢杆菌>异常汉逊酵母菌>发酵时间>干酪乳杆菌。表2的方差分析结果表明，3种微生物的接种量及发酵时间等4个因素，皆极显著地影响发酵豆粕中酸溶蛋白含量。

表1 正交试验测得的发酵豆粕中酸溶蛋白含量

组别试验因素枯草芽孢杆菌(A)/%异常汉逊酵母(B)/%干酪乳杆菌(C)/%发酵时间(D)/h酸溶蛋白含量/%1000246．92011488．43022728．34101728．05112249．861204811．27202489．98210729．292212412．0K123．624．827．328．8K229．027．428．429．5K331．131．528．025．4x17．98．39．19．6x29．79．19．59．8x310．410．59．38．5R2．52．20．41．1

表2 发酵豆粕中酸溶蛋白含量的正交试验方差分析

变异来源平方和自由度均方FP校正模型62．987．9233．4<0．0001A29．8214．9442．1<0．0001B22．8211．4338．5<0．0001C0．720．39．60．0014D9．724．8143．4<0．0001误差0．6180总变异63．626

2.3 发酵豆粕中活菌数的检测

表3的正交试验结果表明，发酵豆粕中活菌总数最高的组合为A3B3C2D3，与酸溶蛋白条件类似，只是发酵时间有所延长。其最适发酵条件如下：枯草芽孢杆菌∶异常汉逊酵母菌∶干酪乳杆菌=2∶2∶1，接种量为5%，最佳发酵时间为72 h。4个因素对活菌总数的影响顺序依次为：枯草芽孢杆菌>发酵时间>干酪乳杆菌>异常汉逊酵母菌。表4的方差分析结果表明，3种微生物的接种量及发酵时间等4个因素，对发酵豆粕中活菌总数的影响均达到了极显著的水平。综合考虑发酵因素对发酵豆粕品质的影响，以酸溶蛋白含量为重点研究对象，把活菌数作为优质发酵豆粕的参考指标。

表3 正交试验测得的发酵豆粕中的活菌总数

表4 发酵豆粕中活菌数的正交试验方差分析

变异来源平方和自由度均方FP校正模型190．7823．82327．0<0．0001A55．7227．82716．2<0．0001B33．4216．71631．8<0．0001C42．8221．42089．1<0．0001D58．8229．42870．8<0．0001误差0．2180总变异190．926

3 讨论

本研究挑选在发酵豆粕中常用的3种微生物，即异常汉逊酵母、枯草芽孢杆菌及干酪乳杆菌作为发酵菌株，并利用四因素三水平正交试验进行复合微生物固态发酵豆粕研究。以抗原蛋白的降解、酸溶蛋白含量以及益生菌活菌数量为指标来优化豆粕发酵的技术参数。从试验结果可以看出，凡是接种了3种菌的试验组的大分子蛋白(大于20 ku)几乎全部降解，之前有研究人员指出，大豆蛋白中的大部分抗营养因子的分子质量均在35 ku以上[10]，这说明本研究所制备的发酵豆粕中大部分抗原蛋白已被降解，具有较高的营养价值。从微生物的配比分析看出，当枯草芽孢杆菌∶异常汉逊酵母菌∶干酪乳杆菌为2∶2∶1时，发酵48 h酸溶蛋白含量明显提高，且枯草芽孢杆菌对酸溶蛋白含量的提高起主要作用，可能是由于枯草芽孢杆菌可分泌蛋白酶，将大分子蛋白降解为小肽、游离氨基酸，使酸溶蛋白含量升高。综合以上结果以及规模化生产的实际需求，发酵豆粕的生产工艺参数以获得最大的酸溶蛋白和抗原蛋白降解为主要指标[11-16]。

枯草芽孢杆菌在高效清除了豆粕中的抗营养因子的同时，作为益生菌有助于肠道对营养物质的吸收，抑制致病菌的生长；异常汉逊酵母通过发酵，可提高发酵产品的风味，增加动物采食量；干酪乳杆菌发酵可产生乳酸等酸性物质，抑制病原菌的生长，同时还产生酸香气味，有利于改善饲料的风味及适口性。3种微生物协同作用，消除了豆粕中的抗原蛋白，提高了豆粕中游离氨基酸含量及其消化吸收率，使豆粕的营养价值得到提升，具有非常重要的意义及广阔的应用前景。

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Study on Technological Index for Soybean Meal Fermentation with Compound Beneficial Microbes

WANG Guoqiang1,WANG Qiuwen2,FAN Chunguang2,LIU Chaoqi2,CHANG Juan2,YIN Qingqiang2*,WANG Erzhu3,LU Fushan4
(1.Nangyang Vocational College of Agriculture,Nanyang 473000，China; 2.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002，China； 3.Henan Delin Biological Product Co. Ltd., Xinxiang453000，China；4.Henan Engineering and Technology Research Center of Feed Microbes,Zhoukou 466000,China)

In order to decrease anti-nutrition factors and increase nutrient values of soybean meal,four-factor and three-level orthogonal design was used to measure the optimal fermenting indexes.The results showed that the optimal ratio of three species of microbes(Hansenulaanomala,BacillussubtilisandLactobacilluscasei) was 2∶2∶1,microbial inoculation quantity was 5%,and fermenting period was 48 h.Under the above conditions,the antigen protein in soybean meal was degraded wholly,acid-soluble protein content was increased by 73.9%,and the total alive microbes reached 8.5×108cfu/g.This fermentation design could significantly increase nutrient value of soybean meal for enlarging its application in feed factory.

beneficial microbes; soybean meal; fermentation; technological index

2016-03-10

河南省科技攻关计划(国际科技合作项目)(豫科[2014]138)

王国强(1964-)，男，河南南阳人，副教授，主要从事畜牧学研究。E-mail:wgq621107@sohu.com

*通讯作者：尹清强(1964-)，男，河南南阳人，教授，主要从事动物营养与生物工程研究。E-mail:qqy1964@126.com

S816.34

A

1004-3268(2016)08-0140-04