小鼠急性肝损伤中谷胱甘肽S转移酶A1的表达分析
2016-02-06刘芳萍常轶聪左咏梅赵常伟李敏敏蔺月霞赵玉林王德宁史晨曦赫景姗佟阿宁
马 欣 , 刘芳萍 , 常轶聪 , 左咏梅 , 赵常伟 , 李敏敏 , 李 睿 , 李 植 ,蔺月霞 , 赵玉林 , 韩 晴 , 王德宁 , 史晨曦 , 赫景姗 , 佟阿宁
(1.东北农业大学动物医学学院 , 黑龙江哈尔滨150030 ; 2.黑龙江省动物卫生监督所 , 黑龙江哈尔滨150001;3.哈尔滨市道外区地方税务局 , 黑龙江哈尔滨150020)
小鼠急性肝损伤中谷胱甘肽S转移酶A1的表达分析
马 欣1, 刘芳萍1, 常轶聪1, 左咏梅2, 赵常伟1, 李敏敏1, 李 睿1, 李 植1,蔺月霞1, 赵玉林1, 韩 晴1, 王德宁1, 史晨曦1, 赫景姗1, 佟阿宁3
(1.东北农业大学动物医学学院 , 黑龙江哈尔滨150030 ; 2.黑龙江省动物卫生监督所 , 黑龙江哈尔滨150001;3.哈尔滨市道外区地方税务局 , 黑龙江哈尔滨150020)
为研究谷胱甘肽S转移酶A1(GSTA1)在3种急性肝损伤动物模型中的表达情况, 选用雄性昆明系小鼠32只, 随机分为4组, 包括CCl4组、APAP组、酒精组和对照组, 按本课题组前期建立的方法复制三种急性肝损伤模型。采集血清检测转氨酶(ALT、AST), 肝脏检测肝组织指标(SOD、MDA、GSH、GSH-Px), 应用RT-PCR方法测定肝组织中GSTA1 mRNA表达量。结果显示, 3种模型组中血清转氨酶及肝组织指标与对照组相比差异极显著(P<0.01); 3种模型组中GSTA1 mRNA的表达量与对照组相比极显著降低(P<0.01), 其中CCl4组降低了4.9倍、APAP组降低了2.1倍、酒精组降低了3.7倍。研究表明, 在急性肝损伤中, GSTA1 mRNA的表达水平与肝损伤的程度呈负相关。
急性肝损伤 ; 小鼠 ; GSTA1 ; mRNA表达
导致肝损伤的原因有很多,目前主要研究的有化学性肝损伤、酒精性肝损伤、病毒性肝损伤和免疫性肝损伤等。谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)是生物转化II相反应中的关键酶,是细胞抗氧化损伤的主要代谢解毒酶系统之一。GSTA1是Alpha类GSTs家族中的重要成员[1]。本课题组前期研究表明,GSTA1可以作为肝损伤标记物[2],同时,GSTA1具有抗氧化损伤作用,能够保护细胞不受脂质过氧化产物的伤害,并且在代谢空气重度污染物多环芳烃中起重要作用[3]。此外,GSTA1还具有抗肿瘤作用和细胞信号调节作用[4]。本试验旨在分析在3种急性肝损伤模型中GSTA1的表达情况,探讨其在急性肝损伤中变化的意义,为研究GSTA1在肝损伤中的重要作用及进一步研究保肝药物提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明系小鼠,体重20±2 g,雄性,清洁级,购自哈药集团制药总厂实验动物中心。
1.2 3种急性肝损伤模型的复制 将32只小鼠随机分为CCl4组、APAP组、酒精组和对照组,每组8只。试验前小鼠隔夜禁食16 h,CCl4组小鼠按照35 mg/kg体重剂量灌胃CCl4油溶液染毒24 h,APAP组按照200 mg/kg体重剂量灌胃APAP染毒12 h,酒精组按照14 mL/kg体重剂量灌胃50%乙醇染毒8 h,对照组不做任何处理。染毒结束后各组眼球采血,制备血清检测谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST);取新鲜肝脏制备肝组织匀浆,检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。
1.3 RT-PCR法检测GSTA1 mRNA的表达水平
1.3.1 总RNA提取 取50-100 mg的新鲜肝脏,使用 TRIZol试剂提取总RNA,利用反转录试剂盒将所提总RNA反转录成cDNA待用。
1.3.2 RT-PCR分析 利用荧光定量PCR试剂盒和RT-PCR 7500系统进行GSTA1 mRNA表达测定,反应体系为20 μL,反应条件:94 °C,5 min变性,40个循环(94 °C,30 s;58 °C,40 s;72 °C,40 s),最后72 °C 5 min。以β-actin mRNA为参照,用于RT-PCR反应的引物序列如表1所示。
表1 RT-PCR引物序列
1.4 数据分析 用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(Dunnett′s法统计分析)。
2 结果
2.1 3种急性肝损伤模型的复制 给予3种试剂(CCl4、APAP、酒精)后,各组小鼠未出现死亡。剖检可见,CCl4组肝脏颜色变浅、肿胀、质地脆弱、弥漫粟粒状小点;APAP组肝脏颜色暗淡、有散在出血点、质地脆弱易碎;酒精组肝脏颜色黯淡、易碎、被膜紧张。3个模型组中,ALT、AST和MDA均明显升高,与对照组相比差异极显著(P<0.01);SOD、GSH、GSH-Px均明显降低,与对照组相比差异极显著(P<0.01),见图1及表2。
2.2 小鼠肝脏中GSTA1 mRNA的表达 三个模型组小鼠肝脏中GSTA1的mRNA表达量均明显下降,与对照组相比差异极显著(P<0.01),见图2。
CCl4组GSTA1 mRNA的相对表达量由1.32降低至0.27,与对照组相比降低了4.9倍;APAP组mRNA的相对表达量由1.32降低至0.62,降低了2.1倍;酒精组mRNA的相对表达量由1.32降低至0.36,降低了3.7倍。
图1 血清中ALT、AST活性
**:与对照组相比差异极显著(P<0.01),下图同
表2 小鼠肝组织指标变化
3 讨论
本课题组前期研究表明,GSTA1比ALT更灵敏更准确,能够在CCl4引起的急性肝损伤早期检测到,可以作为肝损伤标记物[5]。本试验3组急性肝损伤模型中,小鼠血清转氨酶活性和肝组织指标均呈极显著变化,表明模型复制成功。在CCl4模型中,GSTA1 mRNA的相对表达量极显著下降,且该模型中各指标是3组模型中变化最大的,其原因可能是CCl4与组织高度结合,导致肝细胞中GSTA1表达受到限制,不能及时参与机体氧化应激反应、清除体内自由基,从而导致肝功能严重损伤。在APAP模型和酒精模型中,各指标与CCl4模型具有类似的变化趋势,其原因可能由于APAP摄入过量,与二磷酸尿苷葡萄糖醛酸(UDPGA)和3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸酯(PAPS)结合的代谢通路饱和,多余的APAP被细胞色素P450酶系氧化生成大量具有毒性的中间产物N-乙酰苯亚胺基醌(NAPQI),导致GSH耗竭,NAPQI与细胞内大分子不可逆共价结合,改变其结构和功能,从而造成大量肝细胞损伤及坏死[6];大量酒精不仅加剧了自由基的产生,而且使体内抗氧化剂耗尽,造成体内的氧化应激反应,损伤细胞膜及细胞线粒体,长期慢性氧化应激会导致肝细胞死亡和肝组织损伤。
在3组急性肝损伤模型中,小鼠肝脏中GSTA1 mRNA的相对表达量均明显下降,说明在复制模型时所使用的诱导物会抑制GSTA1的表达,阻止其参与机体氧化应激反应,从而导致肝功能严重受损、达到破坏肝脏的目的,由此可见,GSTA1在肝脏保护方面极为重要。在本试验中,综合血清转氨酶、肝组织各指标及肝脏GSTA1 mRNA表达分析,发现了一个趋势,CCl4导致损伤最为严重,其次是酒精,最后是APAP,可能是因为3种药物与肝组织结合方式不同造成的,CCl4是亲肝化工原料,可直接破坏肝细胞膜,极易导致肝细胞的变性。
本研究成功复制了3种小鼠急性肝损伤模型。GSTA1 mRNA的表达水平与肝损伤的程度呈负相关,即损伤越严重其表达水平越低。本试验在基因水平上再一次证明GSTA1对于急性肝损伤模型的评价具有重要的意义,同时为进一步研究GSTA1基因调控的分子机制奠定了基础,亦为高通量保肝药物筛选提供了基础理论依据。
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Expression ofglutathione S-transferase A1 in acute hepatic injury on mice
MA Xin1, LIU Fang-ping1, CHANG Yi-cong1, ZUO Yong-mei2, ZHAO Chang-wei1, LI Min-min1, LI Rui1, LI Zhi1, LIN Yue-xia1, ZHAO Yu-lin1, HAN qing1, WANG De-ning1, SHI Chen-xi1, HE Jing-shan1, TONG A-ning3
(1.College of Veterinary Medicine , Northeast Agricultural University , Harbin 150030 , China ; 2.Animal Health Supervision Institute of Heilongjiang Province , Harbin 150001 , China ; 3.Daowai Local Taxation Bureau of Harbin , Harbin 150020 , China)
To analyze the expression of glutathione S-transferase A1 (GSTA1) in three acute hepatic injury models, 32 male Kunming mice were randomly divided into 4 groups, CCl4, APAP, alcohol and control. Three hepatic injury models were replicated according to the methods established by our research group. Serum levels of transaminases (ALT and AST) and liver homogenate indicators (SOD, MDA, GSH and GSH-Px ) were tested and GSTA1 mRNA expression was determined by RT-PCR. The results showed that transaminases serum levels and liver homogenate indicators were significantly changed (P<0.01),and GSTA1 mRNA expression was significantly decreased (P<0.01),which were by 4.9 times (CCl4model), 2.1 times (APAP model) and 3.7 times (ethanol model). These results indicated that mRNA expression levels of GSTA1 in liver are negatively correlated with the degree of hepatic injury.
acute hepatic injury; mice; GSTA1; mRNA expression
LIU Fang-ping
2016-01-22
国家自然科学基金项目(31472241);黑龙江省应用技术研究与开发计划项目(PC13S03)
马欣(1990-),女,硕士生,研究方向为兽医药理学与毒理学,E-mail: 578521569@qq.com
刘芳萍,E-mail:fangpingliu@126.com
S859.7
A
0529-6005(2016)12-0102-03