传染性囊病病毒VP5 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

孙晓霞 ， 蔺文成 ， 李晓齐 ， 曹 红 ， 王永强 ， 郑世军

(中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室 ， 北京海淀100193)

传染性囊病病毒VP5 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

孙晓霞 ， 蔺文成 ， 李晓齐 ， 曹 红 ， 王永强 ， 郑世军

(中国农业大学动物医学院农业生物技术国家重点实验室 ， 北京海淀100193)

传染性囊病病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus，IBDV)的非结构蛋白VP5 在病毒感染细胞的不同阶段发挥着抑制或诱导细胞凋亡的重要作用。为制备抗血清I 型IBDV VP5 蛋白的单克隆抗体，取经His-VP5 蛋白免疫4 次的BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，3次亚克隆后获得2株能稳定分泌VP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为5EC7和2BE5。经间接ELISA 测定，以上2株单抗的亲和力解离常数分别为1.14×10-10和4.87×10-10，亚类分别为IgG2a 和IgG1。通过Western Blot 和间接免疫荧光试验检测，2 株单抗均能识别IBDV 感染DF-1 细胞后产生的VP5 蛋白。Western Blot 试验表明，2 株单抗识别的抗原表位区域为VP5 N-端的1～10 aa。该单抗为研究血清I型IBDV VP5蛋白的生物学功能及病毒致病机理奠定基础。

传染性囊病病毒 ； VP5蛋白 ； 原核表达 ； 单克隆抗体

传染性囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是一种以危害雏鸡为主的急性、高度传染性的免疫抑制性疾病，其病原为传染性囊病病毒(IBDV)。IBDV 能损伤B 淋巴细胞前体，诱导其凋亡，抑制机体体液免疫应答，从而诱导机体产生免疫抑制[1]，使病禽易继发感染其他病原，给养殖业带来严重的经济损失。

IBDV 属于双RNA 病毒科禽双RNA 病毒属，病毒基因组由A 和B 两个片段的双股RNA 组成[2]。A 片段包括两个开放性阅读框(Open reading frame，ORFs)，分别编码病毒非结构蛋白VP5和多聚蛋白pVP2-VP4-VP3，pVP2-VP4-VP3 前体蛋白可被VP4 蛋白水解酶水解为病毒蛋白VP2、VP3 和VP4[3]。B 片段编码VP1 蛋白。VP5 是病毒的非结构蛋白，不参与病毒粒子的组成[4]。在IBDV 感染的早期，VP5 蛋白可与PI3K 的p85α亚基结合抑制Akt 的激活，从而抑制细胞凋亡的发生，该作用对于病毒的增殖具有重要意义[5]。而在IBDV 感染晚期，VP5蛋白与电压依赖性阴离子通道2(VDAC2)结合，促进细胞色素c等促凋亡因子的释放，激活内源性细胞凋亡通路，促进细胞凋亡和病毒释放[6]。本研究制备了能稳定分泌抗血清I 型IBDV VP5 蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞系，为进一步研究VP5 蛋白在IBDV 感染过程中的功能和IBDV的致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、质粒、菌株、细胞与实验动物 传染性囊病病毒IBDV Lx 毒株由北京市农林科学院刘爵研究员惠赠。pET-28a-VP5 重组质粒、pGEX-6p-1 表达质粒、大肠杆菌E.coli DH5α和E.coli BL21、骨髓瘤细胞(SP2/0)、DF-1 细胞、HEK293T 细胞以及His-VP5 蛋白由本实验室保存。4～8 周龄雌性BALB/c 小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所。

1.2 主要试剂和仪器 DMEM 高糖培养基，购自Gibco 公司；胎牛血清，购自HyClone 公司；HRP 标记山羊抗小鼠IgG 和FITC 标记兔抗小鼠IgG，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；限制性内切酶、LA Taq 酶和DNA 快速连接试剂盒，购自TaKaRa 公司(中国大连)；高纯度小量快速提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；HAT、HT、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents，购自SIGMA 公司(美国)；96 孔板酶标仪，购自TECAN公司。

1.3 抗VP5 单克隆抗体的制备 小鼠免疫程序按照罗正等所述方法进行[7]。细胞融合和阳性杂交瘤细胞的筛选参照Current Protocol in Immunology[8]的方法进行。腹水的制备纯化参考文献[8]所述方法进行。

1.4 单抗亚类及表位识别鉴定 亚类鉴定按照SIGMA 公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 试剂盒说明书进行。将实验室保存的VP5 的8 个截短表达质粒分别转染HEK293T 细胞，收集细胞蛋白，利用Western Blot 方法检测单克隆抗体对截短体的识别情况。

1.5 单抗亲和力的测定 以1 μg/mL 的GST-VP5融合蛋白包被酶标板，分别以2 株纯化后的单抗为一抗，2 株单抗的初始浓度均为2 μg/mL，依次进行倍比稀释，将其加入酶标板后按照常规ELISA 操作进行，测定OD450 nm 值。试验数据的处理按照文献[9]所述方法。

1.6 单抗特异性检测及对天然感染状态下VP5蛋白的识别以实验室保存的病毒感染后的细胞蛋白为抗原，分别以5EC7 和2BE5 株单抗做一抗，以Western Blot 法检测单抗对各病毒蛋白的识别情况。

将DF-1 细胞接种于24 孔板，待细胞密度达到80%时，用IBDV 感染DF-1细胞，24 h后弃去病毒液，4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100 进行透化，1% BSA封闭，抗VP5单克隆抗体作为一抗，FITC标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，经反应、洗涤后，荧光显微镜下进行检测。

2 结果

2.1 单克隆抗体亚类及亲和力的鉴定 经鉴定，5EC7 株和2BE5 株单抗重链类型分别为IgG2a 和IgG1。如图1所示，5EC7和2BE5的亲和力解离常数(Kd)分别为1.14×10-10和4.87×10-10，均为高亲和力抗体。

2.2 单抗特异性检测及对天然感染状态下VP5蛋白的识别 如图2A，2株单抗只识别IBDV感染细胞后产生的VP5 蛋白，不能识别其他病毒蛋白。如图2B 和2C，间接免疫荧光试验表明，2 株单克隆抗体能识别IBDV感染DF-1细胞后产生的VP5 蛋白。以上结果表明，2 株单抗均为针对IB.DV VP5蛋白的特异性抗体。

图1 单抗亲和力测定

图2 单抗特异性检测

A：Western Blot检测单抗识别IBDV感染产生的VP5蛋白； B：1～6：IBDV感染组； 1：抗IBDV 阳性血清，2：SPF鸡阴性血清，3：IgG1同型对照，4：IgG2a同型对照，5-6：5EC7和2BE5株单抗； C：1～4：未感染组；1：抗IBDV 阳性血清，2：SPF鸡阴性血清，3～4：5EC7和2BE5株单抗

单克隆抗体抗原识别区域的鉴定：如图3 所示，2株单抗的识别位点均位于1～50位氨基酸之间；Western Blot 进一步分析表明1 株单抗的识别位点均位于1～10位氨基酸之间，如图4所示。

图3 单抗抗原识别区分析(I)

图4 单抗抗原识别区分析(II)

3 讨论

IBD 主要侵害鸡的体液免疫中枢器官腔上囊等淋巴组织，因此危害不仅表现在疫病本身，更会引起鸡体的免疫机能障碍，影响各种疫苗的免疫应答，甚至导致免疫失败。由于免疫抑制，引起继发和并发其他疾病，致死率升高，给养鸡业带来严重灾害[10]。非结构蛋白VP5 在感染的不同阶段发挥着抑制或诱导细胞凋亡的作用对病毒的增殖和扩散具有重要意义。

本研究获得的2 株不同亚型的杂交瘤细胞株，其分泌的单抗可有效识别血清I 型IBDV 感染细胞后表达的VP5 蛋白。利用His-VP5 蛋白免疫BALB/c 小鼠，用GST-VP5 蛋白作为ELISA 包被抗原对杂交瘤细胞株进行筛选，可有效防止筛选到抗His 蛋白的杂交瘤细胞株。本研究用于筛选的GST-VP5 蛋白为可溶性融合蛋白，其大小约为43 kDa，但纯化后有4 个主条带，经Western Blot 鉴定，4 个条带均可被GST 单抗识别，这可能是由于融合蛋白断裂造成的。巨噬细胞和胸腺细胞能分泌有促进杂交瘤细胞生长的IL-6，而传统的饲养层细胞(即小鼠腹腔巨噬细胞)易污染杂交瘤，本研究使用4～6 周龄未经免疫的BALB/c 小鼠的胸腺，制备无菌细胞悬液培养杂交瘤细胞代替传统的饲养层细胞[9，11]，取得了较好的效果。

秦立廷等制备了针对血清II 型IBDV VP5 的单克隆抗体[12]，但并不能识别危害养禽业的血清I 型的VP5 蛋白；张宁等制备了抗血清I 型IBDVVP5 的单克隆抗体[13]，但其抗原识别区并不明确。本研究制备的针对血清I 型IBDV VP5 蛋白的单克隆抗体，抗原识别区位于1～10位氨基酸，并且可有效识别IBDV 感染细胞12 h～36 h 表达的VP5蛋白。有助于深入研究非结构蛋白VP5的功能，为疫苗研发和IBDV 致病机理的探索奠定基础。

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Development and identification of monoclonal antibodies against Infectious Bursal Disease Virus(IBDV)VP5

SUN Xiao-xia ， LIN Wen-cheng ， LI Xiao-qi ， CAO Hong ，WANG Yong-qiang ， ZHENG Shi-jun

(State Key Laboratory of Agrobiotechnology and College of Veterinary Medicine China Agricultural University，Beijing 100193，China)

VP5 is a nonstructural protein of IBDV and plays an important role in inducing or inhibiting apoptosis during IBDV infection.In order to develop monoclonal antibodies(McAbs)against IBDV VP5，we vaccinated BALB/c mice with His-VP5 protein. Hybridomas were generated by fusing mouse myeloma cells SP2/0 with the splenocytes from the immunized mice.After screening and subcloning，we obtained 2 hybridoma cell lines(5EC7，and 2BE5)that stably secreted McAbs against the IBDV VP5.The dissociation constants(Kds)of these McAbs were 1.14×10-10and 4.87×10-10，respectively.The isotypes of these McAbs were IgG2a and IgG1.These McAbs specially bound to VP5 in IBDV-infected DF-1 cells as demonstrated by Western Blot and indirect immunofluorescence assay.The recognition regions of these McAbs were all located between 1to 10 aa of VP5 as demonstrated by Western Blot.These McAbs will be useful in analyzing the biological activities of VP5and the mechanisms of IBDV infection.

Infectious Bursal Disease Virus ； VP5 ； prokaryotic expression ； monoclonal antibody

ZHENG Shi-jun

2015-06-03

国家自然科学基金(31272543)；现代农业产业技术体系建设专项资金(NYCYTX-41)

孙晓霞(1990-)，女，硕士生，主要从事病原与宿主相互作用机制的研究，E-mail：sxxburning@163.com

郑世军，E-mail：sjzheng@cau.edu.cn

S852.465+9.4

A

0529-6005(2016)12-0010-04