副猪嗜血杆菌同一质粒携带blaROB-1和aacA-aphD耐药基因

杨守深 ， 孙 坚 ， 范克伟 ， 杨小燕 ， 廖晓萍

(1.龙岩学院生命科学学院， 福建 龙岩 364012； 2. 福建省家畜疫病防治与生物技术重点实验室， 福建 龙岩 364012； 3. 华南农业大学兽医学院， 广东 广州 510642)

副猪嗜血杆菌同一质粒携带blaROB-1和aacA-aphD耐药基因

杨守深1,2， 孙 坚3， 范克伟1,2， 杨小燕1,2， 廖晓萍3

(1.龙岩学院生命科学学院， 福建 龙岩 364012； 2. 福建省家畜疫病防治与生物技术重点实验室， 福建 龙岩 364012； 3. 华南农业大学兽医学院， 广东 广州 510642)

探讨1株副猪嗜血杆菌携带介导β-内酰胺类药物耐药基因blaROB-1耐药质粒的基因环境。抽提阳性菌的耐药质粒，采用电转法将耐药质粒转入DH5α，运用Southern blot确定耐药基因blaROB-1的位置，通过测序获得耐药质粒的基因组成结构。结果表明，该菌携带有2个质粒，其中1个质粒(pQY431-1)携带有耐药基因blaROB-1，该质粒成功转入受体菌DH5α，转化子较受体菌对阿莫西林、头孢克洛、庆大霉素、卡那霉素以及阿米卡星的MIC分别提高了64倍、16倍、 32倍、64倍和2倍。该质粒全长为7 777 bp，其基因环境由潜在的移动和复制区、一个截断的ISApl1插入序列、耐药基因aacA-aphD和blaROB-1组成。

副猪嗜血杆菌；抗菌药；耐药基因；基因环境

副猪嗜血杆菌 (Haemophilusparasuis, HPS) 属于革兰阴性菌，主要引起猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎, 又称格拉瑟病 (Glässer′s disease)。兽医临床上，β-内酰胺类抗生素常被用于治疗该病。本课题组对华南地区临床分离的145株副猪嗜血杆菌进行药物敏感性分析，并对β-内酰胺类药物耐药基因检测时，发现其中1株菌QY431携带有blaROB-1耐药基因，对部分β-内酰胺类药物产生耐药，如青霉素、头孢克洛，但是对头孢噻呋(<0.064 μg/mL) 和头孢噻肟(<0.064 μg/mL) 高度敏感；该菌还对氨基糖苷类药物庆大霉素产生耐药。因此，本文拟对该菌耐药基因环境进行研究，分析耐药基因的组成结构及其传播机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TSA和TSB，购自OXOID公司；MH琼脂和LB琼脂，购自广东环凯微生物科技有限公司；血清，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，添加量为5%。辅酶I，购自Omiga公司，配置浓度为2 μg/mL。质粒 DNA 提取试剂盒，购自德国QIAGEN公司；Southern杂交试剂盒，购自美国Roche 公司；ExTaq聚合酶，购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR引物合成由深圳华大基因科技服务有限公司完成。

1.2 耐药质粒的提取和Southern杂交 质粒DNA提取和Southern杂交均按照试剂盒使用说明书进行操作。

1.3 电转及转化子鉴定 取2.5～5 μL质粒DNA加入到DH5α感受态细胞，进行脉冲(2.5 kV)电击后，取100 μL涂布于含有10 μg/mL头孢克洛的LB琼脂上。挑取生长的单菌落进行PCR检测是否含有blaROB-1基因(blaROB-1-F：5′-TGTTGCAATCGCTGCC-3′，blaROB-1-R：5′-TTATCGTACACTTTCCA-3′)鉴定其是否为阳性转化子。

1.4 药物敏感性分析 药敏试验的测定参考NCCLS(2002)推荐方法，采用96孔酶标板二倍稀释法测定各菌株的MIC值，耐药折点参考文献报道[1]。大肠杆菌DH5α和转化子药物敏感性测定按照CLSI推荐方法(2010)。药敏试验以胸膜肺炎放线菌 ATCC 27090和大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌。

1.5 质粒测序 抽提转化子质粒DNA，并测序，将结果通过DNAStar软件中的EditSeq进行序列拼接，然后提交NCBI。

2 结果

2.1 耐药质粒抽提及基因定位 成功抽提菌株QY431的质粒，该菌含有两个质粒，分别是 ～7 kb和 ～6 kb，命名为pQY431-1和pQY431-2；通过电击转化的方法，质粒pQY431-1成功转入E.coliDH5α感受态细胞，并抽提转化子质粒DNA，原菌及转化子质粒电泳图见图1中的 I。运用地高辛标记blaROB-1探针，通过Southern杂交技术，确定blaROB-1位于 ～7 kb的质粒上，见图1中的II。

图1 质粒电泳及Southern杂交图

注：M：V517；I：1，QY431质粒图，2，转化子质粒图；II：1 QY431质粒杂交条带，2，转化子质粒杂交条带

2.2 转化子的MIC结果 转化子的药物敏感性试验结果见表1。转化子与受体菌相比阿莫西林、头孢克洛、庆大霉素、卡那霉素以及阿米卡星的MIC分别提高了64倍，16倍，32倍，64倍和2倍。其中转化子对阿米卡星的MIC升高不明显，仅从0.25 μg/mL上升到0.5 μg/mL，对链霉素的MIC不变。

表1 QY431、转化子和受体菌的MIC比较

注：副猪嗜血杆菌对头孢克洛、青霉素和庆大霉素耐药折点分别是 ≥ 8 μg/mL，≥ 4 μg/mL和 ≥ 16 μg/mL

2.3 质粒序列分析 pQY431-1完全测序，全长为7 777 bp (KC405065)，由潜在的移动和复制区、一个截断的ISApl1插入序列、耐药基因aacA-aphD和blaROB-1组成，见图2。从图中还可得出pQY431-1与pFS39 (KC405064) 相比，除耐药区中aacA-aphD不同外，其余组成部分相同。

图2 质粒pQY431-1与质粒pFS39、pB1002和pB1000的基因环境比较

质粒pQY431-1中ISApl1序列与pB1002相比在其内部缺失了659 bp，然而，他们的3′ 和 5′ 端都完整保留见图2。通过序列分析发现，在ISApl1内部有2个片段序列分别是TCGTTC和TCGTTTC，他们仅差一个碱基T，巧合的是在ISApl1截断部分正好是这两段序列中间的区域和其中一段的TCGTTTC，见图3。

图3 质粒pQY431-1截断IS Apl1的基因环境

3 讨论

由于抗菌药长期不规范使用，细菌产生耐药性，常常造成兽医临床治疗失败。目前在副猪嗜血杆菌中仅发现两种可介导β-内酰胺类药物耐药的基因，分别是blaTEM型和blaROB-1[2]。其中，耐药基因blaROB-1不仅介导青霉素，阿莫西林，氨苄西林耐药，还可介导第二代头孢克洛耐药[3]；但是该耐药基因对第三代头孢菌素，如头孢噻呋和头孢噻肟高度敏感。本试验曾以工程菌J53、C600作为受体菌，研究质粒pQY431-1的可转移性。虽然不断通过优化共培养的条件，但是最终都未能获得结合子。Gonzalez-Zorn等在研究质粒 pB1000时，同样以大肠杆菌作为受体菌，也未能获得结合子[4]。这可能有很多因素影响结合试验，虽然副猪嗜血杆菌和大肠杆菌都属于阴性杆菌，但是他们自身的生物学特性都差别很大。

序列分析发现，质粒pQY431-1与pFJS5863 (HQ015159) 的同源率高达99%；与pFS39拥有相似的结构，它们还与质粒pHN61 含有相同的移动和复制区[5]。以上质粒可能从一个相同或相近的耐药质粒，经过演变而来。细菌产生钝化酶是对氨基糖苷类药物耐药的重要耐药机制之一，其中aacA-aphD基因编码的修饰酶可引起庆大霉素、卡那霉素交叉耐药，过度表达时还可对阿米卡星耐药[6]。在本试验中，转化子对庆大霉素和卡那霉素的MIC较受体菌有明显提高，但是对阿米卡星的MIC与受体菌相比仅从0.25 μg/mL增加到0.5 μg/mL。插入序列ISApl1 在胸膜肺炎放线菌AP76首次确认并命名[7]，在质粒pQY431-1中，插入序列ISApl1内部缺失了659 bp，但两端仍旧保留，该现象同样在质粒pFS39中发生。ISApl1对blaROB-1的移动可能扮演着重要角色，ISApl1功能有待于进一步深入研究。

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Co-location of the bla ROB-1 gene and aacA - aphD gene on a small plasmid in Haemophilus parasuis

YANG Shou-shen1,2, SUN Jian3, FAN Ke-wei1,2, YANG Xiao-yan1,2, LIAO Xiao-ping3

(1.College of Life Sciences, Longyan University, Longyan 364012, China; 2. Fujian Provincial Key Laboratory for the Prevention and Control of Animal Infectious Diseases and Biotechnology, Longyan 364012, China; 3. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China )

The purpose of this article was to analyze the genetic environment of theblaROB-1gene in oneHaemophilusparasuisstrain，which conferring resistance to β-lactam antibiotics. Plasmid DNA was extracted and introduced into anE.coliDH5α by electroporation. TheblaROB-1gene was shown by Southern blot hybridization. The plasmid was sequenced to analyze the genetic environment of the resistance gene. The results showed that the strain carryied two plasmids. One plasmid (pQY431-1) was successfully introduced into a DH5α recipient. The transformant showed 64-, 16-, 32-, 64- and 2-fold increases in the MICs of amoxicillin, cefaclor, gentamicin, kanamycin and amikacin, respectively, when compared with the recipient strain. It was 7777 bp long, consisting of the potential mobilization and replication region, a truncated ISApl1 and the resistance genesblaROB-1andaacA-aphD.

Haemophilusparasuis; antibiotics; resistance gene; genetic environment

LIAO Xiao-ping

2016-05-18

广东省自然科学基金(S2012030006590)

杨守深(1982—)，男，讲师，博士，主要从事兽医药理学研究，E-mail ：31526230@qq.com

廖晓萍，E-mail：xpliao@scau.edu.cn

S852.61

A

0529-6005(2016)12-0075-03