鸵鸟Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定、血清型鉴定以及Hexon蛋白基因序列分析

李昌静 , 王冬冬 , 王建琳， 王守春， 郭妍妍 , 尹燕博,3

(1.青岛农业大学动物科技学院， 山东青岛266109； 2.青岛澳兰百特生物工程有限公司，山东青岛266101； 3.中国鸵鸟养殖开发协会鸵鸟疫病防制中心， 山东青岛266109)

鸵鸟Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定、血清型鉴定以及Hexon蛋白基因序列分析

李昌静1, 王冬冬1, 王建琳1， 王守春2， 郭妍妍2, 尹燕博1,3

(1.青岛农业大学动物科技学院， 山东青岛266109； 2.青岛澳兰百特生物工程有限公司，山东青岛266101； 3.中国鸵鸟养殖开发协会鸵鸟疫病防制中心， 山东青岛266109)

对3份来自不同地方的病死鸵鸟进行病理剖检、病原分离鉴定，确诊为Ⅰ群禽腺病毒感染，并成功分离到3株鸵鸟FAV-Ⅰ。采用PCR方法成功扩增2株临床分离株的Hexon基因，分别克隆于pMD20-T载体，对其进行了核苷酸序列测定、同源性比较及遗传进化分析。并运用Ⅰ群禽腺病毒12个标准毒阳性血清对其中2株毒进行了血清型鉴定。结果显示，分离株2014.07.10-HBHD-TN、2014.07.19-HBHS-TN与12个标准株之间的同源性在72.5%～98.0%之间，其中与FAV-4的同源性最高是98.0%。在系统进化树中，这两个分离株均位于FAV-I的大分支中，且与FAV-4位于同一小分支。这2个分离株经血清学鉴定均为血清4型的毒株。

鸵鸟； FAV-Ⅰ； 分离鉴定； 序列分析； 血清学鉴定

禽腺病毒(Fowladenovirus, FAV)属于禽腺病毒科禽腺病毒属，根据其抗原性的不同可分为3个群，Ⅰ群禽腺病毒包括从鸡、火鸡、鹅和其他禽类分离的共12个血清型，它们都含有相同的群抗原。从鸡体内分离到Ⅰ群禽腺病毒的情况已有很多报道，但从鸵鸟体内分离到Ⅰ群禽腺病毒的报道不多。在鸵鸟养殖场，鸵鸟的发病、死亡以及不良的孵化率都与腺病毒有关[1]。本实验室分别在2014年7月10日、7月19日以及9月4日接诊了来自河北不同地方的3批疑似Ⅰ群禽腺病毒感染的鸵鸟病例，并对其进行病理剖检，病毒的分离鉴定，血清型鉴定以及基因系统进化树分析。

1 材料

毒株、试剂及血清 病料样品来自我国河北省几个鸵鸟养殖场；SPF种胚，购自山东省无特定病原鸡实验种鸡场，由本实验室孵化；克隆Ⅰ群禽腺病毒Hexon蛋白全基因所用菌株为感受态细胞DH5α和pMD20-T载体，购自宝生物工程(大连)有限公司产品；Ⅰ群禽腺病毒12个血清型标准毒的阳性血清(由本实验室制备并保存)。

2 方法

2.1 引物设计与合成 根据GenBank中Ⅰ群禽腺病毒CELO株(AAU46933)的Hexon基因序列，应用Premier 5.0设计了Ⅰ群禽腺病毒的检测引物和Hexon全基因的测序引物[由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]如下[2-3]：

表1 本研究中应用的引物

2.2 样品处理 对来自我国河北省几个鸵鸟养殖场的疑似Ⅰ群禽腺病毒感染的鸵鸟进行剖检、病理变化观察，并取肝组织和肾组织按1:5的比例加入生理盐水进行研磨，研磨后放-20℃冰箱反复冻融后备用。

2.3 病毒的鸡胚分离 将处理后样品经5 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，通过卵黄囊途径接种10日龄SPF鸡胚，0.2 ml/L胚，同时设阴性对照。置37 ℃温箱孵育24 h剔除死胚，收获48 h以后死亡胚及19日龄活胚，并记录鸡胚死亡时间，观察鸡胚各组织器官的病变。按上述方法连传3代后，收取胚肝和胚肾组织进行PCR鉴定。

2.4 鸡胚分离物的PCR鉴定 胚肝和胚肾组织经处理后，离心取上清液，按常规方法提取核酸[3]，再按以下PCR程序进行扩增：采用30 μL的PCR反应体系：DNA 模板2 μL，10×PCR Buffer(Mg2+free)3 μL,MgCl2(25 mmol/L)4 μL, dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，检测引物FAV-1、FAV-2各0.5 μL(25 nmol/L),加灭菌超纯水17 μL，经94 ℃ 5 min预变性，然后94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 90 s，30个循环扩增，72 ℃终延伸10 min。4 ℃保存。反应结束后取PCR产物8 μL，以DL-2 000为Marker，1%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小。

2.5 2个分离株的血清型鉴定 将经鸡胚传3代且PCR检测为阳性的鸡胚分离物作为病毒抗原，用未接毒的SPF鸡胚胚肝和胚肾的混合样作为阴性对照抗原，用Ⅰ群禽腺病毒12个血清型标准毒的阳性血清作为抗体，运用双向免疫琼脂扩散试验对病毒进行血清学分型。

2.6 2个分离株Hexon蛋白基因序列测定及系统进化树分析 按常规方法提取核酸，并用测序引物A1A2、B1B2、C1C2对目的基因进行PCR扩增。再将扩增的目的基因与pMD19-T载体进行连接，然后将连接产物转化到感受态细胞DH5α中，涂平板进行蓝白斑筛选,将白色菌落接种到LB液体培养基中，置37 ℃剧烈震荡培养12～16 h后，进行PCR鉴定后[4]，将阳性菌液送生工生物工程(上海)有限公司进行测序。测序结果经DNAStar软件剪切拼接，得到完整的目的基因序列。

应用MEGA 4.1软件，通过Clustal W方法，以Hexon基因编码区核苷酸序列为基础，对本研究2个分离株Hexon全基因与Ⅰ群禽腺病毒12个标准血清型代表株Hexon全基因(本实验室测定-序列待提交)以及GenBank已注册的禽腺病毒FAV-Ⅰ的代表株AAU46933(CELO株)，参考株AY849321、AF074946 (同属FAV-Ⅱ)，Y09598 (属FAV-Ⅲ)Hexon全基因进行核苷酸同源性邻近排组分析，构建Hexon全基因系统发育进化树。

3 结果

3.1 临床病理学观察 发病鸵鸟不能站立，以肘关节着地，食欲减退，逐渐消瘦，肘关节肿大。剖检可见，肝脏肿大，边缘钝圆，色浅呈土黄色，有条索状出血；心脏畸形，心内膜有出血点；肺脏出血、淤血，有的可见豌豆大小增生物，呈乳白色；气管出血；肾脏胰腺出血。

3.2 鸡胚的病变观察 接种鸡胚后第5天出现死胚，第7天到第8天为死亡高峰，收集死胚及19日龄的未死胚。剖检，观察发现绒毛尿囊膜有不同程度增厚，呈云雾状。胚体发育不良，瘦小，羽毛稀少，有的体表潮红。肝脏肿大、出血，质脆呈灰黄色，有的表面及边缘可见灰白色坏死点，边缘有时呈灰白色弥漫性坏死。肾脏有不同程度肿大、出血。对照组正常无病变。

3.3 鸡胚分离物的PCR鉴定 腺病毒的特异性引物对鸡胚分离物和阴性对照进行PCR扩增后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可以在508 bp处看见明显的扩增条带，而阴性样品未扩增出条带(如图1所示)。结果说明，本次试验成功分离到3株Ⅰ群禽腺病毒的鸡胚分离物。

图1 鸡胚分离物PCR检测结果

3.4 2个分离株的血清型鉴定结果 利用Ⅰ群禽腺病毒12个血清型标准毒的阳性血清，运用双向免疫琼脂扩散试验对病毒进行血清学分型结果显示，在2株分离株与血清4型的阳性血清之间均可见一条清晰的白色沉淀线，但与其他几个阳性血清之间没有沉淀线出现，说明本实验室从鸵鸟体内分离到的2株Ⅰ群禽腺病毒是属于血清4型。

3.5 2个临床分离株Hexon全基因遗传进化分析 同源性分析发现，2个分离株、12个标准株与FAV-Ⅰ的代表株AAU46933(CELO株)之间的同源性在74.8%～99.9%,与参考株AY849321、AF074946 (同属FAV-Ⅱ)，Y09598 (属FAV-Ⅲ)的同源性分别是48.9%～52.5%、51.2%～57.5%。除此之外，分离株2014.07.10-HBHD-TN、2014.07.19-HBHS-TN之间的同源性为100%，且与12个标准株之间的同源性在72.5%～98.0%之间，其中与FAV-4的同源性最高是98.0%(如图2所示)。

图2 2个临床分离株与禽腺病毒Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群代表株基因序列之间的同源性比较

如中插彩版图3所示，12个血清型代表株和2个临床分离株与Ⅰ群禽腺病毒(FAV-Ⅰ)代表株AAU46933(CELO株)位于同一个大的分支，亲缘关系较近，表明12个血清型代表株和2个临床分离株同属于Ⅰ群禽腺病毒。并且这2个分离株均位于FAV-4所在的分支。参考株AY849321、AF074946 (同属FAV-Ⅱ)，Y09598 (属FAV-Ⅲ)位于另外两个分支，与 FAV-Ⅰ群亲缘关系则较远。

4 讨论

Ⅰ群禽腺病毒可以通过接种鸡胚和细胞进行分离鉴定，常用的鸡胚接种途径有3种：卵黄囊接种，绒毛尿囊膜接种，尿囊腔接种。绒膜尿囊膜途径接种较尿囊腔接种更易分离到病毒[5]，但有报道已指出11个血清型的毒株经卵黄囊接种，可以在胚体中繁殖，而绒毛尿囊膜接种稍差[6]。血清学方法是I群禽腺病毒分型的常规方法[7-8]。分子生物学方法，如PCR、测序等，是通过比较分析基因序列对毒株进行基因分型。所以，本试验采用了卵黄囊接种途径，通过接种SPF鸡胚成功从鸵鸟样品中分离到3株Ⅰ群禽腺病毒。并运用血清学方法成功鉴定了其中2个分离株2014.07.10-HBHD-TN、2014.07.19-HBHS-TN的血清型，且这2个分离株均为血清4型。对这2个分离株进行同源性以及系统进化树分析发现，两分离株之间的同源性为100%，且都与FAV-4的同源性高达98.0%。除此之外，这两个分离株在系统进化树上与FAV-4是位于同一分支。

以上数据表明，本次试验分离到的2个毒株是同一毒株在不同地方的感染，且该毒株可能是由于当地的家禽所携带的毒感染了野鸟，由野鸟带到鸵鸟养殖场感染了鸵鸟，这只是一种推测，具体的情况还需要进一步考证。

从鸵鸟中分离到血清4型的Ⅰ群禽腺病毒，在我国还没有报道。虽然在国外有从鸵鸟体内分离到Ⅰ群禽腺病毒的先例，但在我国并没有得到足够多的重视。本试验表明，Ⅰ群禽腺病毒已经开始对我国鸵鸟养殖业产生影响了，这提示我们广大鸵鸟养殖户应该从现在开始做好Ⅰ群禽腺病毒的预防。

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Gene sequence analysis of hexon protein and separation identification and serotype identification of fowl adenovirus group Ⅰin ostrich

LI Chang-jing1， WANG Dong-dong1， WANG Jian-lin1， WANG Shou-chun2， GUO Yan-yan2， YIN Yan-bo1,3

(1.College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2.Qingdao Oland-Better Biological Engineering company, Qingdao 266001, China; 3.China association of ostrich farming development and epidemic prevention center, Qingdao 266109, China)

Three cases of ostriches came from different parts were diagnosed with fowl adenovirus of groupⅠ infections and 3 strains of FAV-Ⅰ were successfully isolated in ostriches. The nucleotide sequences of DNA of hexon gene of 2 isolates were amplified by PCR, and cloned into pMD20-T carrier, The cloned genes were then sequenced and analyzed. Serotypes of 2 isolates were identified by comparing with 12 serotype standard strains of fowl adenovirus group Ⅰ. The results showed that the homology between isolates of 2014.07.10 HBHD-TN, 2014.07.19 HBHS-TN and 12 standard strains is 72.5%-98.0%. Of them , it has the highest homology with FAV-4, which is up to 98.0%. In system evolutionary tree, both the two isolates were located in the same big branch of FAV-Ⅰ, and in the same small branches with FAV-4. The two isolates were identified as strains of serotype 4 by serological identification.

Ostrich; FAV-Ⅰ;isolation and identification; sequence analysis; serological identification

YIN Yan-bo

2015-11-16

畜禽重大疫病防控与高效安全养殖综合技术研发重点专项(2016YFD0500806);山东省自然科学基金(ZR2010CM 014)；山东省现代农业产业技术体系家禽产业创新团队(SDAIT-13-011-03)

李昌静(1987-)，女，硕士，研究方向为兽医病理学及相关分子生物学，E-mail:lichangjing2007_@126.com

尹燕博，E-mail:yanboyin2011@163.com

S852.65

A

0529-6005(2016)12-0014-03