甘露聚糖酶微水固相法改性皂荚多糖胶

刘彦涛，许正龙，林雪娇，孙达锋，张卫明，蒋建新*

(1. 北京林业大学材料科学与技术学院，林业生物质材料与能源教育部工程研究中心，北京 100083；2. 南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042 )



甘露聚糖酶微水固相法改性皂荚多糖胶

刘彦涛1，许正龙1，林雪娇1，孙达锋2，张卫明2，蒋建新1*

(1. 北京林业大学材料科学与技术学院，林业生物质材料与能源教育部工程研究中心，北京 100083；2. 南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042 )

作为功能性天然高分子，皂荚半乳甘露聚糖胶资源丰富。基于多糖胶吸水润胀特点提出的微水固相酶法改性皂荚多糖胶，在微水吸胀过程同时渗入酶进行改性反应，微水吸胀后的胚乳片经压片处理后呈蓬松多孔雪花片状，反应比表面积加大。β-甘露聚糖酶降解皂荚多糖胶，加酶量在3000～4000 U/(g胚乳)范围内，加水量为0.9倍胚乳片质量，在40 h反应时间后可得到最大低聚糖含量，为18.17%。微水固相法酶解半乳甘露聚糖可节约酶用量成本且易操作，避免了多糖胶溶液的高粘度性对酶解带来的不便，对多糖胶酶法改性的工业化应用有重要意义。

皂荚；半乳甘露聚糖胶；微水固相；酶法改性

皂荚(GleditsiasinensisLam.)为豆科(Legminosae)苏木亚科的多年生木本植物，可生长在多种环境条件下，在我国河北、山东、福建、江苏、广东等地区分布广泛，可以作为天然植物应用于医药，食品和保健品等领域[1]。植物多糖胶是可提供各种功能性增值产品的高分子碳水化合物，半乳甘露聚糖的一个重要来源是植物多糖胶，是存储性多糖，存在于种子胚乳细胞壁[2]。已有研究系统性表述了皂荚、野皂荚等种子组成和多糖胶性质[3]，并通过核磁共振方法研究表征了多糖的化学结构[4]，几种种子的胚乳质量分数在30%～40%范围，聚糖在种子胚乳中约占70%左右；其中1%浓度的皂荚多糖胶具有最高为274 mPa·s的表观粘度。

植物多糖胶的改性分为化学改性和酶法改性，化学改性主要通过官能团衍生化和接枝聚合两种方式实现。降低多糖胶的分支度会提高与其他多糖形成共凝胶的能力。降低多糖胶的分子量会使溶液黏度降低，可在食品中起到膳食纤维的作用[5]。酶法改性的两种形式主要分为解聚主链和脱支链。β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)和α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)为半乳甘露聚糖胶改性主要用到的两种酶[6-8]。β-1, 4-D-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)，简称β-甘露聚糖酶，是能够水解含β-1, 4-D-甘露糖苷键的内切水解酶，属于半纤维素酶类[9-10]。不同的β-甘露聚糖酶产生的低聚糖性质不同，这说明酶的反应方式不同[11]。β-甘露聚糖酶存在于各种生物体，包括植物、细菌、真菌和软体动物中。通常，β-甘露聚糖酶若来源于真菌，则其作用偏酸性，而细菌产的β-甘露聚糖酶作用接近中性或偏碱性，稳定性也较好。不同植物产生的β-甘露聚糖酶的分子量、温度和pH作用范围、等电点、底物专一性、酶动力学常数等都有一定的差异。本研究采用微水固相法利用β-甘露聚糖酶降解皂荚多糖胶半乳甘露聚糖，主要探究了适当加水比及均相反应温度等条件下，不同加酶量和反应时间范围对改性产物低聚糖和单糖含量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验原料、试剂及标准品

皂荚荚果由河北涉县供销社提供，手工剥离得到皂荚种子，使用烘烤法分离种子中的胚乳胶。将一定量种子放入微波炉中预处理一定时间，取出后使用粉碎机击打，从种皮和胚中分离胚乳片。

无水乙醇、3,5-二硝基水杨酸钠、无水亚硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等均为分析纯。

单糖标准品包括L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖，购于美国Sigma-Aldrich公司；系列葡聚糖标准分子量样品DXT3k、DXT25k、DXT160k、DXT760k、DXT1185k的平均分子量范围为3.6×103Da～1.2×106Da，均购自日本TosoHaas公司；低聚糖标准品1, 4-β-D-甘露四糖(纯度不低于95%)、1, 4-β-D-甘露三糖(纯度不低于95%)、1, 4-β-D-甘露二糖(纯度不低于95%)购自爱尔兰Megazyme公司。β-1, 4-D-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)，简称β-甘露聚糖酶(β-mannanase)，为能够水解含β-1, 4-D-甘露糖苷键的内切水解酶，由中国科学院微生物研究所提供。

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，SHJ-I水浴恒温磁力搅拌器(金坛市美特仪器制造有限公司)，立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，UV-2000型紫外-可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)，Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 β-甘露聚糖酶活力的测定

DNS溶液的配制：称取3.15 g(精确至0.001 g)3, 5-二硝基水杨酸钠，加入500 mL去离子水后在45 ℃水浴中不断搅拌。随后，向溶液中缓慢加入100 mL浓度为5 mol/L的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌直至溶液清澈透明。在加入氢氧化钠溶液的过程中要注意溶液温度不超过48 ℃。之后再向溶液中逐步加入91.0 g(精确至0.001 g)四水酒石酸钠、2.50 g(精确至0.001 g)重蒸苯酚和2.50 g(精确至0.001 g)无水亚硫酸钠。继续在45℃水浴中恒温搅拌并补加300 mL去离子水，期间不断搅拌至全部溶解。待溶液冷却至室温后，转移到棕色容量瓶，加入去离子水定容至1 000 mL，混合均匀并在室温下避光保存7天。用烧结玻璃过滤器过滤后将滤液储存在棕色瓶中，避光保存，有效期为6个月。

那么推什么？一言以蔽之，就是推进廉洁政治建设。干部清正、政府清廉、政治清明，是习近平总书记推进反腐倡廉建设思想的目标和理念。干部清正，不仅仅对执政党自身的建设和国家政权体系的建设有利，更是对整个社会风气的健康发展有重要作用。清廉是共产党领导的人民政府应有的本质特征。政治清明，是社会主义国家的内在要求。中国共产党领导广大人民群众进行民主政治建设，理应是清明的政治。

配制pH为6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，并用其配制质量浓度为10 g/L(0.1 mol/L)的皂荚胶溶液。取1 mL质量浓度为10 g/L的皂荚胶溶液，加入0.1mL用蒸馏水适当稀释的酶溶液，再加入0.9 mL乙酸-乙酸钠缓冲液，于40℃水浴中恒温反应(底物浓度增加会使酶的最适温度相应提高)，用DNS显色法测定还原糖含量。酶活力单位(U)定义为在40 ℃、pH为6.0的条件下，1 min内催化质量浓度为5 mg/mL的皂荚胶(GSG)底物生成1μmol还原糖(以甘露糖表示)所需的酶量。

1.3.2 β-甘露聚糖酶微水固相改性皂荚多糖胶

以水溶液中酶解皂荚半乳甘露聚糖胶为基础，预实验后设定实验所需β-甘露聚糖酶用酶量及反应温度等条件。所用原料为扁皂荚种子，使用烘烤法粉碎去除种子外壳，得到皂荚胚乳片，为微水固相法酶解所用半乳甘露聚糖。在一定温度的少量水溶液中溶解一定量的β-甘露聚糖酶，随后加入胚乳片进行吸水溶胀的水合过程，2 h左右后待胚乳片吸胀完全处于半干状态，使用三辊研磨机压片处理为雪花片状，随后进入均相反应器完成酶解反应。一定反应时间后放入高压蒸汽灭菌锅，在121 ℃下高温灭酶20 min。取出后放于65 ℃烘箱内烘干水分，使用粉碎机粉碎并通过120目筛(颗粒尺寸小于0.125 mm)，得到淡黄色粉末样品。

1.3.3 β-甘露聚糖酶微水固相改性产品表征

样品通过高效液相色谱法表征微水固相法酶解所得产物。

使用HPLC测定单糖量。将样品稀释至适当浓度，通过0.22 μm滤膜过滤。高效液相色谱为Waters 2695 HPLC系统，配有Aminex HPX-87P柱(300 mm×7.8 mm，Bio-Rad)及2414 RID示差折光检测器。柱温85 ℃，检测器温度35 ℃，进样量为10 μL，流动相为双蒸水，流速0.6 mL/min。使用单糖标准品包括L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖来随柱进行校准。

使用Waters 2695 HPLC系统测定低聚糖产物。配备SUGAR PAK I(6.5 mm×300 mm；Waters)和2414RID示差折光检测器。在检测过程中，柱温恒定在85 ℃，检测器温度为30 ℃。流动相为双蒸水，流速为0.5 mL/min。进样量为10 μL。

通过凝胶渗透色谱(GPC)分析样品分子量分布。GPC系统柱为TSK PWXL保护住、TSKgelG6000 PWXL和TSKgelG3000 PWXL(TosoHaas)，并配有示差折光检测器。流动相为pH 6.8的磷酸盐缓冲液，浓度为0.2 mol/L，流速为0.6 mL/min。将样品稀释至0.1 g/L左右浓度，在进样前通过0.22μm滤膜。测定时柱温保持在35 ℃。使用一系列平均分子量为3.6×103Da～1.2×106Da的葡聚糖标准溶液校正柱子。使用软件Empower2(Waters)计算得到平均分子量Mw和Mn。

2 结果与分析

β-甘露聚糖酶耐高温，选择最适温度60 ℃左右水合，水合过程中胚乳片吸水膨胀，最终变得柔软有弹性，水合后的胚乳片经对辊机辊压成雪花片状，装入均相反应器反应。反应温度80 ℃，转速60 r/min。β-甘露聚糖酶的酶活为362 732 U/g。以不加酶样品作为空白对照。

β-甘露聚糖酶微水固相法酶解皂荚多糖胶胚乳片，采用不同水量和加酶量酶解，反应40 h，各项参数如表1所示。

表1 β-甘露聚糖酶微水固相法降解皂荚多糖胶40h工艺参数

β-甘露聚糖酶1#2#3#4#5#6#7#8#9#胚乳片重量(g)20．020．020．020．020．020．020．020．020．0水合加水比1∶0．71∶0．71∶0．71∶0．81∶0．81∶0．81∶0．91∶0．91∶0．960℃水(g)14．014．014．016．016．016．018．018．018．0加酶量(U/g胚乳)200030004000200030004000200030004000甘露聚糖酶(g)0．11030．16540．22050．11030．16540．22050．11030．16540．220580℃均相反应时间(h)404040404040404040

β-甘露聚糖酶可以水解甘露五糖、甘露六糖的主要产物为DP2～3和DP2～4的低聚糖，甘露四糖进一步水解为甘露三糖和甘露二糖。实验的结果是使用β-甘露聚糖酶微水固相改性皂荚多糖胶半乳甘露聚糖，可得到平均聚合度均在5以下的产物，高效液相色谱测定得到一定含量甘露二糖、三糖和四糖，表明微水固相方法的可行性。其中二三四糖及总低聚糖的变化趋势如图1所示。

由图1可见，一定含水量条件，低聚糖含量基本随酶量增加而增加，其中较少水量(0.7)情况最多酶量所得低聚糖含量略低，推测是由于水量过少，胚乳片吸胀过程未能吸收所有的酶，导致均相反应所利用的酶量不足。随着水量的增加，同等加酶量的样品所得低聚糖含量增加，表明在微水环境的前提下，水量的增多有助于酶对胚乳片的作用，增加低聚糖的产生。在加水量在0.8以上时，低聚糖得率较高，酶含量和水含量的增加对低聚糖的总量影响不大，实验所得低聚糖含量最多为18.17%，在0.9倍固体重量加水量和4 000 U/g胚乳加酶量得到。而通过对比可看出，反应产生的低聚糖中甘露二糖和甘露三糖较多，甘露四糖较少，在β-甘露聚糖酶微水固相酶解40h内的反应过程中，更易作用于甘露四糖产生越来越多的三糖和二糖，需要继续探究不同时间段微水固相酶解得到低聚糖的情况。

图1 不同加水比和β-甘露聚糖酶量微水固相法降解皂荚多糖胶所得低聚糖含量(80℃，40h)

酶解所得单糖到四糖的总和按1～9号顺序分别为16.71%，21.81%，20.86%，21.03%，29.89%，30.09%，25.96%，29.04%，31.76%。在适宜用水量较高用酶量条件下产生的甘露糖单糖可达10%以上，说明一定反应时间内，适宜加水和加酶量条件下，酶解过程中的转糖基作用形成越来越多单糖，这对酶解反应产生低聚糖产生不利影响。

2.2 β-甘露聚糖酶微水固相法降解24 h内产品表征

根据阶段试验结果改进工艺，选取合适含水量和更大加酶量，在微水前提下选取最适水量(0.9)，使用4 000 U/(g胚乳)和5 000 U/(g胚乳)加酶量进行反应，80 ℃均相反应6 h，12 h，18 h和24 h后得到产品。具体参数如表2所示。

图2 不同时间和β-甘露聚糖酶量微水固相法降解皂荚多糖胶所得低聚糖含量(80℃)

β-甘露聚糖酶改性1#2#3#4#5#6#7#8#胚乳片重量(g)20．020．020．020．020．020．020．020．0加水比1∶0．91∶0．91∶0．91∶0．91∶0．91∶0．91∶0．91∶0．960℃水(g)18．018．018．018．018．018．018．018．0加酶量(U/g胚乳)40005000400050004000500040005000甘露聚糖酶(g)0．22050．27570．22050．27570．22050．27570．22050．2757均相反应时间(h)66121218182424

表3 β-甘露聚糖酶微水固相法长时间降解皂荚多糖胶工艺参数

24 h内的β-甘露聚糖酶微水固相改性所得低聚糖和低聚糖含量变化情况如图2所示，在24 h内，4 000 U/(g胚乳)的加酶量下反应所得的低聚糖均远少于40 h所得，单糖含量较40 h较少但差距不大。随着时间的增加，甘露二糖和甘露三糖的含量是逐渐增加的趋势，两者的总量最高为13.13%，此时加酶量为5 000 U/(g胚乳)，其中所有样品甘露四糖的得率过低，在高效液相色谱中未检测出，这可能是由于24 h的反应时间内，β-甘露聚糖酶依然主要作用在较易降解的甘露四糖，生成甘露三糖和甘露二糖，在18 h之后，酶量的增加对低聚糖含量的影响不大。在这种实验条件下仍有10%的甘露糖单糖生成，降解所得1～8号样品单糖和寡糖总和分别为10.90%，12.14%，19.35%，20.42%，20.37%，24.73%，23.53%，25.72%。减少反应时间不能保证减少甘露糖单糖的生成。

2.3 β-甘露聚糖酶微水固相法降解72～96 h产品表征

根据以上实验结果改进条件，选取适合加水比1∶0.9进行实验，加酶量分别为4 000 U/(g胚乳)，5 000 U/(g胚乳)和6 000 U/(g胚乳)，由于实验过程中发现若继续加大酶量，微水状态下酶液过稠，无法使胚乳片进行良好的吸胀，所以确定最大加酶量为6 000 U/(g胚乳)，反应时间加长，为72 h和96 h，各项参数如表3。

图3所示为不同加酶量在反应时间为72 h和96 h时的低聚糖含量变化，在最大反应时间和用酶量条件下的低聚糖得率最高，为17.33%，产物的单糖含量均在10%以上，较之前方法并没有明显减少，反应得到产物按照1～6编号顺序单糖到四糖的总含量分别为25.26%，25.34%，25.10%，24.54%，26.78%，31.15%。可看出，在反应72 h左右时，酶量的增加对低聚糖和单糖的影响都不明显，随着反应时间继续延长，在96 h后酶量增加会使低聚糖和单糖含量相应增加，但较40 h反应时4 000 U/(g胚乳)加酶量的结果仍然较低，而在较长反应时间情况下，4 000 U/(g胚乳)及以上加酶量下产物单糖到四糖的总量也相对减少，推测原因可能为长时间的反应中，适量的β-甘露聚糖酶更多作用于半乳甘露聚糖分子产生长链聚糖，产生四糖及以下糖基较少，转糖基作用也有所减弱。

图3 β-甘露聚糖酶量微水固相法降解72～96h皂荚多糖胶所得低聚糖含量(80℃)

2.4 β-甘露聚糖酶微水固相法降解皂荚多糖胶分子量分布

根据以上对各条件下的产物进行分子量测定分析，结果如图4。采用GPC对β-甘露聚糖酶微水固相改性皂荚多糖胶得到的样品进行重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)的测定，未加酶的样品为对照。与糖含量测定结果相吻合，Mw和Mn的值与原胶相比有明显的下降，Mn值的降低是由于酶解过程中生成了一定量的小分子，而多分散性(Pi=Mw/Mn)表示多糖的均匀性，下降表明反应生成不同长度大小的聚糖。与72 h和96 h反应时间所得产物相比，40 h反应的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)均较低，试验条件范围内，降解产品的分子量及多分散性与反应时间无明显规律。

图4 不同条件下β-甘露聚糖酶微水固相改性皂荚多糖胶产物的分子量(Mw和Mn)和多分散指数(Pi=Mw/Mn)变化

3 结 论

(1)24 h短时间和72～96 h较长时间，微水固相酶解反应得到低聚糖含量较40 h偏低，同时仍得到10%左右甘露糖单糖副产物，在0.9倍加水比和3 000～4 000 U/(g胚乳)的加酶量降解40 h 低聚糖含量达到最大值18.17%。

(2)在反应中仍然存在产物中有大量甘露糖单糖等问题，可能是因为转糖基作用或酶的纯度略有缺陷，固相反应可能存在反应器中物料不均匀的情况。以本研究为基础，可使用荧光标记法，进一步研究酶在微水固相中扩散规律。微水固相法酶解半乳甘露聚糖可节约酶用量成本，适合实际生产，对多糖胶的工业化应用有重要意义。

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β-Mannanase Modified Gleditsia sinensis Gum Using Micro-water-solid-phase Methods

Liu Yantao1, Xu Zhenglong1, Lin Xuejiao1, Sun Dafeng2, Zhang Weiming2, Jiang Jianxin1*

(1.College of Material Science and Technology, MOE Engineering Research Center of Forestry Biomass Materials and Bioenergy,Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2. Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042, China )

Galactomannan gums are functional natural polymers, which are rich in the seeds ofGleditsiasinensis. Modification of galactomannan in micro-water-solid-phase is a innovative method proposed based on the swelling characteristics of the polysaccharide gums. While swelling in small amount of water, the enzymes were absorbed for the modification reaction, and imbibed endosperms were fluffy with snow flake after the pressure treatment. Modification of galactomannan using β-mannanase in micro-water-solid-phase obtained a maximum oligosaccharide content of 18.17 %, with the amount of enzyme in 3000-4000 U/(g endosperm) , water∶endosperm=0.9 and reaction for 40 h. Enzymatic modification of galactomannan in micro-water-solid-phase saves the cost of enzyme. It is easily operated and successfully avoids the inconvenience of high viscosity of gum solution. This new method is suitable for the practical production and has a significant impact on the industrial application of polysaccharide gum modification.

Gleditsiasinensis; Galactomannan gums; micro-water-solid-phase; enzymatic modification

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.06.003

2016-05-23

国家重点研发计划课题(2016YFD0600803)和国家自然科学基金项目(31270624)。

刘彦涛(1991—), 男, 硕士研究生，主要从事多糖利用研究工作。

*通讯作者： 蒋建新，教授，博士生导师，研究领域为林产化工及生物质能源。E-mail:jiangjx@bjfu.edu.cn

Q539

A

1006-9690(2016)06-0012-05