利用秀丽线虫评价4种食药用菌水提物抗氧化活性

林群英, 吴亮亮, 张锋伦, 吴素玲, 项春荣, 孙晓明*

(1.南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042；2.江苏鸿丰果蔬食品有限公司，江苏 宿迁 223700； 3.镇江市丹徒区正东生态农业发展中心，江苏 镇江 212000)



利用秀丽线虫评价4种食药用菌水提物抗氧化活性

林群英1,2, 吴亮亮1,2, 张锋伦1, 吴素玲1, 项春荣3, 孙晓明1,2*

(1.南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042；2.江苏鸿丰果蔬食品有限公司，江苏 宿迁 223700； 3.镇江市丹徒区正东生态农业发展中心，江苏 镇江 212000)

利用秀丽线虫为模型对桦褐孔菌、灵芝、云芝、灰树花水提物进行抗氧化活性评价。结果表明：桦褐孔菌水提物最佳抗氧化浓度为0.2 mg/mL，线虫平均寿命为7.84 d，比对照组延长了1.17倍；灵芝、云芝和灰树花水提物最佳抗氧化浓度均为1.0 mg/mL，线虫平均寿命分别为8.84 d、6.75 d、5.98 d，比对照组分别延长0.92倍、1.08倍和1.20倍。研究结果为这些食药用菌的开发提供有用的参考依据。

桦褐孔菌；灵芝；云芝；灰树花；抗氧化

目前我国已成为世界第一大食用菌生产国。据对全国27个省、自治区、直辖市统计调查，2014年全国食用菌总产量3 270万吨，产值2 258.1亿元[1]。食用菌富含蛋白质、膳食纤维、维生素、微量元素等营养成分[2]，还含有多糖、黄酮等活性成分[3]，具有营养及保健价值。随着研究的深入开展，食用菌的活性功能越来越受关注。金针菇(Flammulinavelutipes)具有抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力和增强记忆的功能[4]。灰树花(Grifolafrondosa)具有良好的护肝、抗肿瘤的活性功效[5]。药用大型真菌的药用功效同样备受关注。据《中国药典》记载，灵芝(Ganodermalucidum)具有补气安神，止咳平喘的功能，同时规定了灵芝含多糖不得少于0.50 %；云芝(Coriolusversiclor)具有健脾利湿，清热解毒的功效，含云芝多糖不得少3.2 %[6]。桦褐孔菌(Inonotusobliquus)是俄罗斯的一种民间药用真菌，具有显著的抗癌作用和抗氧化活性[7-8]。食药用真菌资源的开发价值已经得到越来越多的证实和认可，为开发保健和功能产品提供了宝贵的生物资源。

秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)是生物研究的理想模式种，其生物学和基因组均得到充分的研究。秀丽线虫易在显微镜下观察，生命周期短，在20oC下平均寿命约为30天，且易于培养。在基因上与人类有60%～80%的相似度，研究结果具有意义，适合进行高通量的功效药物筛选[9]。因具有以上众多优势，除了在基础研究方面的应用，秀丽线虫在药物筛选、功能评价等方面也已经得到越来越广泛的应用[10-11]。在植物和微生物资源功能评价方面均有应用，在大型真菌方面亦开始有报道[12]。利用模式生物秀丽隐杆线虫可以有效区分不同产地灵芝的生物活性[13]。灵芝多糖可延长线虫寿命，被认为具有良好的抗衰老作用[14]。本研究以秀丽线虫为模型，对桦褐孔菌、灵芝、云芝和灰树花等4种食药用真菌的抗氧化活性进行研究，为开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与原材料

百草枯和5-氟尿嘧啶均购自Sigma公司，其余试剂为国产试剂。灰树花由上海森明公司提供；灵芝和云芝为市售产品，产地为辽宁；桦褐孔菌提取物由杭州百山祖生物科技有限公司提供。

1.2 秀丽线虫

野生型秀丽线虫 N2由美国Caenorhabditis Genetics Center(CGC)提供。

1.3 实验方法

1.3.1 水提物制备

将桦褐孔菌、灵芝和云芝粉碎至20目以下，按1∶20 (w/v)的比例加水煮沸2 h，纱布过滤后，再提取1次，将2次滤液合并，进行旋转蒸发浓缩至生药浓度为100 mg/mL。桦褐孔菌提取物用水溶解成水溶液，4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 抗氧化活性评价

秀丽线虫同步化及培养按参考文献[15]，利用野生型秀丽线虫N2进行。将水提物配制成一定浓度后，添加至培养有秀丽线虫的96孔板中，于20 ℃培养培养48 h，随后往每个孔里添加百草枯至终浓度为40 mmol/L，继续培养。每天记录线虫存活数目，直至线虫全部死亡。以0.5 mm粗的铂金丝轻触线虫，无反应者记为死亡。每组实验所测线虫数目不少于80条。

1.3.3 寿命试验

根据抗氧化活性评价结果，用最佳浓度对N2进行寿命试验。挑取同步化的L4期线虫到各组含水提物的NGM平板培养基中，每组不低于100条。于20 ℃培养，从转移时刻开始计算线虫存活天数，转移当天记为寿命实验第0天，每天检查线虫，纪录死亡数。

2 结果与分析

2.1 桦褐孔菌水提物抗氧化活性

桦褐孔菌物水提物在低浓度(0.2 mg/mL)时可明显提高秀丽线虫的抗氧化能力，最大寿命为13 d，高长于对照组(9 d，图1a)。但随着浓度的提高，桦褐孔菌物水提物在0.5 mg/mL和1.0 mg/mL时，其抗氧化能力反而下降，平均寿命分别为5.12 d和5.45 d，均低于0.2 mg/mL处理组的平均寿命(7.84 d)，而高于对照组(4.08 d，图1b)。

图1 桦褐孔菌水提物对百草枯处理的秀丽线虫寿命的影响

图2 灵芝水提物对百草枯处理的秀丽线虫寿命的影响

2.2 灵芝水提物抗氧化活性

在高浓度灵芝水提物(1.0 mg/mL)的处理下，秀丽线虫的抗氧化能力最强，最大寿命为15 d，显著高于对照组的最大寿命，(9 d，图2a)，平均寿命为8.84 d，比对照组延长了4.40 d(图2b)。在中低浓度下，灵芝水提物的抗氧化能力下降，平均寿命为3.69 d，短于1.0 mg/mL处理组的平均寿命，但仍长于对照组(图2b)。

2.3 云芝水提物抗氧化活性

云芝水提物具有良好的抗氧化活性。浓度为1.0 mg/mL时，秀丽线虫的抗氧化能力最强，最大寿命为12 d，显著高于对照组的最大寿命，(8 d，图3a)，平均寿命为6.75 d，明显长于对照组(3.25 d，图3b)。在0.2 mg/mL和0.5 mg/mL的浓度下，云芝水提物的抗氧化能力出现下降，平均寿命分别为4.90 d和5.15 d，但比对照组长(图3b)。

图3 云芝水提物对百草枯处理的秀丽线虫寿命的影响

图4 灰树花水提物对百草枯处理的秀丽线虫寿命的影响

2. 4 灰树花水提物抗氧化活性

灰树花水提物具有良好的抗氧化活性。浓度为1.0 mg/mL时，秀丽线虫的抗氧化能力最强，最大寿命为13 d，显著高于对照组的最大寿命(7 d，图4a)，平均寿命为5.98 d，明显长于对照组(2.72 d，图3b)。0.5 mg/mL的浓度下，灰树花水提物的抗氧化能力下降，平均寿命为4.88 d，比对照组长(图3b)。水提物浓度为0.1 mg/mL时，无抗氧化活性，最大寿命和平均寿命分别为4 d和2.66 d，均低于对照组。

2.5 抗衰老活性评价

通过分析4种食药用菌对秀丽线虫寿命的影响，可反映其抗衰老活性。在桦褐孔菌、灵芝、云芝和灰树花水提物最佳浓度下，线虫的最大寿命分别为19 d、19 d、20 d和18 d，均延长了线虫的寿命，平均寿命则分别为14.55 d、14.65 d、14.15 d和13.7 d(图5a,b)。与对照组比较，除灰树花无显著性差异外，其余3种水提物均有明显的差异。

图5 4种食药用菌水提物对正常培养的秀丽线虫寿命的影响

3 小结与讨论

利用秀丽线虫对桦褐孔菌、灵芝、云芝和灰树花的抗氧化活性进行研究。因秀丽线虫为活体模型，与体外自由基方法相比，评价结果更具参考价值。通过添加百草枯引起线虫出现氧化应激损伤，加速其死亡速度。这4种食药用菌的水提物均能在很大程度上保护线虫，延缓其死亡速率。灰树花将平均寿命延长了1.20倍，桦褐孔菌、灵芝和云芝分别延长了1.17倍、0.92倍和1.08倍。可见，灰树花的抗氧化活性最强。但这一结果与抗衰老活性的结果不一致。这可能是由于衰老是一个更为复杂的长时间过程，受影响的因素众多，而抗氧化只是延缓衰老其中一个因素[16]。利用果蝇为模型和体外试验分别证实桦褐孔菌菌丝体和子实体多糖具有抗氧化能力，与本文结果相一致[17-18]。本文以秀丽线虫为生物模型分析食药用菌的抗氧化活性，更直接有效地评价其抗氧化功能，为食药用菌的开发提供有力的参考依据。

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Evaluation of Antioxidant Activities of Four Edible/Medicinal Mushroom Water Extracts Using Caenorhabditis elegans

Lin Qunying1, 2, Wu Liangliang1, 2, Zhang Fenglun1, Wu Suling1, Xiang Chunrong3, Sun Xiaoming1,2

( 1. Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042, China; 2. Jiangsu Hongfeng Fruit and Vegetable Food Co., Ltd., Suqian 223700, China; 3. Zhenjiang City Dantu District Zhengdong Ecological Agriculture Development Center, Zhenjiang 212000, China)

Evaluation of antioxidant activities of four edible/medicinal mushroom water extracts was performed usingCaenorhabditiselegans. The results showed that the best concentration of water extact ofInonotusobliquuswas 0.2 mg/mL, with mean lifespan at 7.84 d, 1.17 folds longer than CK. The optimized concentrations were all at 1.0 mg/mL forGanodermalucidum,CoriolusversiclorandGrifolafrondosa. The mean lifespans were 8.84 d, 6.75 d and 5.98 d, respectively, 92%, 108% and 120% longer than CK. The findings could provide useful reference for further exploration of these mushrooms.

Inonotusobliquus;Ganodermalucidum;Coriolusversiclor;Grifolafrondosa; antioxidant

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.06.004

2016-05-12

“十二五”国家科技支撑计划资助项目(2013BAD16B07)。

林群英(1979―)，女，博士，副研究员，研究方向：食用菌栽培与应用研究。E-mail: linqunying1007@126.com

*通讯作者： 孙晓明(1964―)，男，硕士，研究员，研究方向：食用菌栽培与深加工。E-mail: sunxm64@163.com

S759.81

A

1006-9690(2016)06-0017-04