羊口疮病毒B2L基因的原核表达、纯化及反应原性分析

石正旺，刘华南，胡永浩，郑海学

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，国家口蹄疫参考实验室，甘肃 兰州 730046)



羊口疮病毒B2L基因的原核表达、纯化及反应原性分析

石正旺1，2，刘华南2，胡永浩1，郑海学2

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，国家口蹄疫参考实验室，甘肃 兰州 730046)

【目的】 克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因，进而纯化并分析其反应原性.【方法】 根据GenBank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物，以提取阳性临床样品的总DNA为模板，通过PCR方法获得ORFV的B2L基因，将该基因片段连接至原核表达载体pET-30a(+)上，获得重组质粒pET-30a(+)-B2L.将此重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆进行扩大培养，经IPTG诱导获得重组融合蛋白.用SDS-PAGE和Western-blotting对表达的目的蛋白进行分析.【结果】 成功获得重组质粒pET-30a(+)-B2L，读码框正确.获得了43 ku的表达产物，与预期目的蛋白大小相符；纯化后的目的蛋白能与ORFV阳性血清发生特异反应.【结论】 成功对ORFV-B2L蛋白进行了原核表达，且纯化后蛋白具有良好的反应原性.

羊口疮病毒；B2L基因；原核表达；纯化；反应原性分析

羊口疮病毒(orf virus，ORFV)即羊传染性脓疮病毒(ecthyma contagiosum virus)，是痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)副痘病毒属(Parapoxvirus)成员[1].副痘病毒属是一类引发动物上皮组织发生病变的相关病毒，可感染绵羊、山羊、骆驼、红鹿、糜、松鼠、海豹、麝牛、羚牛和人[2-11]，本属成员还有牛丘疹性口内炎病毒(bovine papular stomatitis virus，BPSV)和假牛痘病毒(pseudocowpox virus，PCPV)，均呈世界范围流行，包括北美和南美，新西兰、芬兰、德国、挪威、日本、中国、意大利、英国、澳大利亚和南非一些国家，甚至南极洲[12-14].ORFV感染后动物的口、眼、鼻周围皮肤出现水泡，然后形成痂皮或者疣状病变[15]，此症状一般持续3-4周，之后动物会出现伏地不起，食欲不振等症状[16]，该病发病率高，但死亡率低，康复动物会出现二次感染，且极度虚弱[17].自19世纪50年代起，在我国10余省份就有相关疫情的报道，其主要流行于我国西北地区.由于其具有高度传染性，及目前高效疫苗的匮乏，该病危害严重，被OIE列为法定必报的动物传染病之一，在我国被列为I类动物传染病[14].

ORFV为双链DNA病毒，基因组长138 kb，编码132个蛋白[18]，该基因组中，中心区域主要编码病毒结构蛋白，两侧区域主要编码和病毒宿主嗜性及毒力相关蛋白[19].ORFV的B2L基因编码一种囊膜蛋白，该基因在不同分离株间具有很高的同源性，因此该基因可用于病毒PCR检测方法的靶标蛋白[17]，此基因全长1 137 bp，位于ORFV基因组5′端，编码产生43 ku大小的囊膜蛋白，囊膜蛋白能刺激宿主机体产生很强的中和抗体，是一种重要的免疫原性蛋白[16].本试验旨在对ORFV-B2L基因进行扩增，并构建原核表达重组载体pET-30a(+)-B2L，转化BL21(DE3)感受态细胞，进行原核表达，并对表达产物进行纯化及反应原性分析，为进一步开发ORFV诊断试剂奠定基础.

1 材料与方法

1.1 ORFV阳性病料、载体及菌株

病料和阳性血清由兰州兽医研究所王光祥助理研究员馈赠，pET-30a(+)表达载体由病毒基因工程课题组保存，E.coliBL21(DE3) 购自宝生物(大连)生物工程公司.

1.3 试验方法

1.3.1 引物的设计与合成 参照GenBank中登录的ORFV-B2L基因序列(GQ328006)， 应用Primer 5.0软件设计扩增ORFV-B2L基因的引物，引物由苏州金维智生物科技公司合成，上游引物序列：5′-CGCGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCATCCCCGTG-3′；下游引物序列：5′-CCG CTCGAG TTATTAATTTATTGGTTTGCAG AACTC-3′,上游引物和下游引物分别引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点(下划线处为酶切位点).

1.3.3ORFV-B2L基因扩增与纯化ORFV-B2L基因的扩增体系：10×LA PCRTMBufferII 5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 8 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，补加RNase Free dH2O 至50 μL.PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s，共35个循环，72 ℃终延伸10 min，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物.

1.3.4ORFV-B2L基因原核表达载体的构建与鉴定 将PCR回收产物和pET-30a(+)载体均用BamHⅠ和XhoⅠ，37 ℃，酶切4 h.对双酶切产物进行纯化，分别取目的片段6 μL，载体1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，T4 DNA Ligase buffer 2 μL，16 ℃连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行培养，提取质粒，进行双酶切鉴定，将鉴定为阳性克隆送至苏州金维智生物科技公司测序.

1.3.5 重组表达菌的诱导表达 将阳性质粒转化BL21感受态细胞，涂布于Kan+(100 μg/mL)抗性的LB平板上，37 ℃过夜培养.挑取单克隆菌落，分别于5 mL Kan+抗性的LB培养基中37 ℃ 220 r/min培养，当D600值达到0.6～0.8时，保存菌液，后加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，继续摇菌5 h.吸取箘液1 mL，12 000 r/min离心收菌，加入80 μL 8 mol/L的尿素，涡旋混匀后室温静置20 min,加入20 μL 5×loading buffer,煮沸8 min后上样8 μL，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，脱色.

2) 从左上角的第一个像素点开始，与设置的5级烧伤颜色阈值进行比较，得出该点的烧伤级别，若无烧伤则标记为0，再统计出已发生烧伤的各像素点的个数。

1.3.6 重组蛋白的可溶性分析 将阳性种子液，扩大200 mL体系培养，并在上述条件下诱导，12 000 r/min离心收取菌粒后，用裂解液悬浮，反复冻融3次，冰浴条件下超声破碎20 min(超声6 s，停8 s)，离心15 min(10 000 r/min ，4 ℃)，收取上清，将沉淀用与上清等量体积的PBS涡旋混匀，分别取上清与沉淀溶液80 μL，加入20 μL 5×loading buffer,煮沸8 min后上样8 μL，进行SDS-PAGE电泳，之后用考马斯亮蓝染色，脱色.

1.3.7 重组蛋白纯化 将1.3.6中收集到的沉淀悬浮液，4 ℃ 10 000 r/min离心15 min，弃去上清，按照Protein Refolding Kit说明书纯化包涵体，后取纯化产物80 μL，加入20 μL 5×loading buffer,煮沸8 min后上样8 μL，进行SDS-PAGE电泳分析.

1.3.8 重组蛋白的Western-blotting分析 将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后，用半干转膜电泳仪转至硝酸纤维素膜上(15 V，25 min)，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，用TBST洗膜3次(水平摇床，10 min/次)，加入1∶500 TBS稀释ORFV感染后羊的阳性血清，摇床4℃孵育过夜，洗膜3次，加入1∶5 000 TBS稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG，摇床室温孵育2 h，洗膜3次，加入ECL显色试剂，之后进行显影.

2 结果与分析

2.1 ORFV B2L基因片段的扩增

对提取的病毒DNA进行PCR扩增，扩增产物约为1 137 bp，与预期相符(图1)，说明通过PCR方法成功获得了B2L基因.

M:DNA分子量标准；1：ORFV-B2L基因扩增产物.图1 ORFV-B2L基因的PCR扩增Fig.1 PCR product for ORFV-B2L gene

2.2 重组质粒的鉴定

将构建的重组质粒pET-30a(+)-B2L经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定得到5382 bp左右的pET-30a(+)载体和1137 bp左右大小的B2L目的条带，符合预期大小(图2)，说明重组质粒构建成功.测序结果进一步表明重组质粒构建成功，且读码框正确.

M:DNA分子质量标准；1：重组质粒的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切产物.图2 重组质粒pET-30a(+)-B2L的双酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-30a(+)-B2L

2.3 重组表达菌的诱导表达

用12%的聚丙烯酰胺凝胶对未诱导样品、诱导样品分别进行检测，结果表明诱导的样品在43.0 ku处有一条特异蛋白条带，与预期大小一致，未诱导样品中则无(图3).表明转化重组质粒pET-30a(+)-B2L的工程菌，经IPTG诱导后，成功地表达了重组蛋白B2L.

M:蛋白质分子质量标准；N:未诱导菌液样品；1-4:诱导的菌液样品.图3 His-B2L在E.coli BL21中的诱导表达分析Fig.3 The expressed protein His-B2L in the E.coli BL21(DE3) cells

2.4 重组蛋白的可溶性分析

将诱导表达的重组菌进行超声处理，离心后，分别收集上清和沉淀样品，加入loading处理后，上样SDS-PAGE进行检测，结果表明重组蛋白B2L主要以包涵体的形式存在于宿主菌中(图4).

M:蛋白质分子质量标准；N:未诱导菌液样品；1-4：诱导菌液上清；5-8：诱导菌液沉淀.图4 His-B2L可溶性分析Fig.4 Solubility analysis of His-B2L

2.5 重组蛋白的纯化

将经包涵体纯化试剂盒Protein Refolding Kit 纯化后的蛋白样品进行SDS-PAGE检测，结果表明对目的蛋白纯化成功(图5)，同时有部分杂带，可能是纯化过程中，IB buffer洗涤次数较少的原因.

M:蛋白分子质量标准；1-3：纯化的包涵体.图5 His-B2L蛋白纯化Fig.5 The purified protein His-B2L

2.6 重组蛋白的Western-blot分析

将纯化后的重组蛋白His-B2L经Western-blot分析，发现在43.0 ku处有目的条带，表明经纯化的目的重组蛋白BL2和ORFV感染血清具有很好的反应原性(图6).

M:蛋白分子质量标准；1:纯化的His-B2L蛋白.图6 His-B2L蛋白Western-blot分析Fig.6 Western-blot analysis of the purified protein His-B2L

3 讨论

羊传染性脓疮病是一种多发于羔羊的，以患病动物的口、眼、鼻周围皮肤出现水泡，之后形成脓包，最后形成痂皮或者疣状病变为特征的接触性传染病[20]，呈世界性分布，危害较为严重，近年来发病率逐年上升，是养殖业中需要重点防控的一类疾病[16].

羊口疮病毒为双链DNA病毒，基因全长134～139 kb，包含130个编码病毒结构蛋白和非结构蛋白的基因，这些基因在基因组中的功能还没有完全被研究清楚，编码病毒毒力因子的基因有OVIFNR、Vil-10和GIF等[21].B2L基因主要编码的囊膜蛋白，不同分离株间的同源性达到97%～98%[13].Gallina L等[22]在2006年首次基于ORFVB2L基因建立了一种关于ORF的real time PCR检测方法.随后，2006年Hosamani等[13]和2007年Chan等[23]基于ORFVB2L基因分别进行了毒株的鉴别和系统进化分析等工作.Abrahao J S等[24]于2012年对5株ORFV毒株基于B2L基因进行了系统进化分析工作，指出不同毒株间B2L基因在核苷酸和氨基酸水平发生了替换，常发生替换位点为009,041,079,111,126,185,196,245,249,256,267,294 和257，5株病毒的同源性为96.9%～99.9%.目前关于B2L蛋白的研究较少，其结构和功能还尚未得到深入的阐述.

在本试验中，笔者尝试优化B2L蛋白原核表达的条件，例如调节培养温度、转速、IPTG浓度，使用不同类型的培养基.经过试验发现，温度在37℃，转速220 r/min，使用营养成分较高的培养基(2×YT)，有利于宿主菌的快速生长和外源蛋白表达量的增加，但在诱导5 h后，菌种生长进入平稳期，此时，延长诱导时间，已不能有效增加蛋白表达量.同时，IPTG在0.4～1 mmol/L时，随着诱导剂的增加，蛋白量呈现增加的趋势，但当诱导剂超过1 mmol/L时，已不能有效地增加蛋白表达量.本试验中，表达的B2L蛋白呈现包涵体形式，可能是受其序列本身和表达质粒的影响.在一些文献中，研究者通过降低温度、IPTG浓度、转速等条件，来控制蛋白的可溶分泌表达，但在本试验中，改变培养条件并未成功实现可溶诱导表达.在本试验中获得的包涵体B2L蛋白，具有和ORFV感染血清很好的反应原性，为进一步制备B2L相关抗体及ORFV临床诊断试剂开发奠定了基础.

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(责任编辑 胡文忠)

Prokaryotic expression,purification and reactogenicity of ORFVB2Lgene

SHI Zheng-wang1,2，LIU Hua-nan2,HU Yong-hao1，ZHEHai-xue2

(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China； 2.State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology,Foot-and-Mouth Disease Reference Laboratory,Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Lanzhou 730046,China)

【Objective】 To clone and express the B2L gene of ORFV,and then purify and analyze the reactogenicity.【Method】 A pair of primer was designed according to ORFVB2Lgene reported in Gen-Bank(GQ328006),taking the DNA of this virus extracted from the pathologic materials as template and the target gene was got by PCR.After purification,the product was cloned into pET-30a(+) vector to ob-tain the recombinant plasmid pET-30a(+)-B2L.After identification,the recombinant plasmid was trans-formed into BL21(DE3) competent cells and the single colony was picked to amplify and culture.After induction with IPTG,the recombinant fusion protein was expressed.The target protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting after purification.【Result】The results showed that theB2Lgene was successfully cloned into pET-30a(+),a protein was confirmed at position about 43 kDa by SDS-PAGE and could specifically react with ORFV positive serum identified by western-blot.【Conclusion】This ex-periment realize the prokaryotic expression of protein B2L,and the purified protein had good reactogenicity.

ORFV;B2Lgene;prokaryotic expression;purification;reactogenicity analysis

石正旺(1990-)，男，硕士研究生，主要从事动物传染病的研究.E-mail:shizw2015@163.com

胡永浩，教授，主要从事预防兽医学研究.E-mail:hyy0817@126.com.cn 郑海学，研究员,主要从事兽医微生物学及其分子生物学研究.E-mail:haixuezheng@163.com

国家“863”计划项目(2011AA10A211-1);国际原子能机构项目(16025/R)；国家自然科学基金项目(31500617).

2015-12-04；

2016-01-27

S 852.6

A

1003-4315(2016)06-0001-05