AOPAN纳米纤维膜的制备及其固定化漆酶研究

武丁胜,凤 权,魏安方,李 鑫,姜银国

(安徽工程大学 安徽省纺织面料重点实验室,安徽 芜湖 241000)

AOPAN纳米纤维膜的制备及其固定化漆酶研究

武丁胜,凤 权,魏安方,李 鑫,姜银国

(安徽工程大学 安徽省纺织面料重点实验室,安徽 芜湖 241000)

利用静电纺丝和偕胺肟化改性制备偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)纳米纤维膜,以戊二醛为偶联剂,其两端的醛基分别与AOPAN纳米纤维膜和漆酶上的氨基反应,进而固定化漆酶.研究了戊二醛交联条件与固定化漆酶的关系,同时测定了固定化漆酶的相关性能,结果表明,当戊二醛质量分数为5%、处理时间为10 h时,固定漆酶效果最好.对游离漆酶与固定化漆酶进行酶促动力学分析发现,固定化漆酶与底物具有较好的亲和性.相对游离漆酶,固定化漆酶对温度和pH值的变化也表现出更好的稳定性,同时具备良好的储存稳定性和重复使用能力.固定化漆酶在4 ℃下保存20 d,酶相对活性保持在63.6%以上,固定化漆酶经重复使用10次,酶相对活性保持在65.7%以上.

偕胺肟化改性;偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)纳米纤维;固定化漆酶;戊二醛交联

漆酶(laccase)是一种多酚氧化酶,能够催化许多酚类化合物发生氧化反应,并使分子氧作为电子受体将其还原成水,其催化底物主要有多酚、甲基替代单酚、芳香胺、苯硫醇、聚甲氧基苯,以及其他容易氧化的化合物等[1-3].因为漆酶具有相当宽泛的底物专一性和较好的稳定性,所以在废水处理、生物漂白、芳香化合物转化、生物传感器构建等方面具有重要的应用价值[4-6].现在大多使用的漆酶主要产生于真菌,在酚类污染物的处理方面,真菌漆酶作为生物催化剂已经显示了良好的应用前景[7-8].

当前,用于固定漆酶的载体主要是纳米颗粒和磁性微球等[9],将偕胺肟化改性的聚丙烯腈(PAN)纳米纤维膜通过戊二醛交联作为固定漆酶的载体则很少有人研究.本文首先利用静电纺丝技术制备PAN纳米纤维膜,通过偕胺肟化改性制备偕胺肟聚丙烯腈(AOPAN)纳米纤维膜,然后与戊二醛一端醛基发生反应,制备纳米纤维膜固定漆酶载体,最后利用纳米纤维膜载体中的醛基与酶的氨基反应固定漆酶.同时,研究了戊二醛的质量分数和处理时间对固定漆酶效果的影响,对比分析了固定化漆酶与游离漆酶的各种性能差异.

1 试 验

1.1 材料及仪器

PAN(粉末状,相对分子质量为90 000)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、盐酸羟胺、乙酸(36%)、乙酸钠、碳酸钠、磷酸(85%)、乙醇(95%)、考马斯亮蓝(G-250),均为分析纯,购于国药试剂网;戊二醛(GA、50%)、愈创木酚,购于阿拉丁试剂网;漆酶(米曲霉菌种),购于安徽酷尔生物科技有限公司.

自制静电纺丝装置(主要包括注射器、注射泵、高压直流电源、纳米纤维接收装置);S-4800型扫描电子显微镜(日本日立公司);IR Prestige-21型傅里叶红外光谱仪(日本岛津公司);UV-5500型紫外可见分光光度计(上海普析科学仪器有限公司).

1.2 AOPAN纳米纤维膜的制备

将PAN粉末溶于DMF溶剂中,制备质量分数为 12%的PAN静电纺丝液. 将纺丝液倒入注射器(规格为10 mL)中,将磨平的针头(规格为7 号)与注射器连接;环境温度为(20±1) ℃,相对湿度为(60±5)%.根据纺丝效果,分别设定流速、接收距离、纺丝电压等工艺参数,静电纺丝时间为10～15 h,将收集的纳米纤维膜在40 ℃条件下的烘箱中烘干120 min,备用.将1 g PAN纳米纤维膜放于浓度为0.2 mol/L、pH值为7、温度为65 ℃的盐酸羟胺溶液中浸泡2 h,再用蒸馏水清洗5次,在40 ℃条件下真空干燥2 h,制备AOPAN纳米纤维膜.同时精确称量反应后纳米纤维膜质量,计算偕胺肟转化率[10].PAN纳米纤维偕胺肟化改性示意图如图1所示.

图1 偕胺肟化反应示意图

Fig.1 Schematic of amidoxime reaction

1.3 AOPAN纳米纤维膜固定漆酶

准确称量0.01 g AOPAN纳米纤维膜(干重),放入一定质量分数的戊二醛溶液中,在25 ℃、40 rad/min条件下慢速振荡,进行一定时间的反应,再用蒸馏水洗去多余戊二醛,将戊二醛改性后的纳米纤维膜浸泡在50 mL、3 g/L漆酶溶液(以pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配置)中,在4 ℃下固定12 h.将固定有漆酶的AOPAN纳米纤维膜用醋酸-醋酸钠缓冲液多次洗涤,直至洗涤液中检测不到漆酶为止,将固定化漆酶于4 ℃条件下储存于上述缓冲液中.AOPAN纳米纤维膜固定漆酶原理如图2所示.

图2 AOPAN纳米纤维膜固定漆酶示意图Fig.2 Schematic of AOPAN nanofibrous membrane immobilized laccase

1.4 漆酶固定量和活性测定

采用Bradford方法测定AOPAN纳米纤维膜对漆酶的固定量.通过测定固定化前后的酶溶液以及清洗固定化酶膜所用醋酸-醋酸钠缓冲液中漆酶的含量,按式(1)计算漆酶的固定量(Ge).

(1)

式中:Ge为漆酶固定量(mg/g);C0为固定前酶溶液中漆酶含量(mg/mL);C1为固定后酶溶液中漆酶含量(mg/mL);C2为冲洗固定化酶膜醋酸-醋酸钠缓冲液中漆酶的含量(mg/mL);V0为固定化试验所用酶溶液的体积(mL);V2为冲洗固定化酶膜所用醋酸-醋酸钠缓冲液的体积(mL);m为用于固定化酶的AOPAN纳米纤维膜的质量(g,干重).

将0.3 mL自由漆酶溶液(3 g/L)及成功固定漆酶的纳米纤维膜(准确称量0.01 g)分别放入8.7 mL、浓度为10 mmol/L的愈创木酚溶液,在50 ℃下反应30 min,于波长465 nm处测试愈创木酚吸光度的变化.漆酶活性单位(U)定义为单位时间内每毫克酶所催化的愈创木酚微摩尔数.漆酶活性计算如式(2)所示.

(2)

式中:v为漆酶活性 (U);A0为初始愈创木酚溶液的吸光度;A为反应一段时间后愈创木酚溶液的吸光度;V1为愈创木酚溶液的体积 (mL);t为反应时间 (min);K为愈创木酚的摩尔消光系数(1.2×104L/(mol·cm) );mw为漆酶的质量(mg).

1.5 游离漆酶与固定化漆酶性能测试

1.5.1 漆酶最适反应温度和pH值

为测定固定化漆酶的最适反应温度,将游离漆酶和固定化漆酶样品放于pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中,在温度为30～70 ℃的条件下,测定漆酶活性.以最高活性为 100%,得出相对活性.

为测定固定化漆酶的最适反应pH值,分别配置pH值为2～7的醋酸-醋酸钠缓冲液各50 mL,将游离漆酶和固定化漆酶样品分别放于上述不同pH值的缓冲液中,测试漆酶活性.以最高活性为 100%,得出相对活性.

1.5.2 漆酶的稳定性

为测试漆酶的储存稳定性,将一批处于湿态的固定化漆酶膜和游离漆酶溶液放置于4 ℃下保存,每隔一段时间取出一份样品测定其活性.通过考察漆酶相对活性的变化,研究漆酶的储存稳定性.

为测定固定化漆酶的重复使用性能,将固定化漆酶膜放入10 mmol/L、pH值为4.5的愈创木酚反应液中,在50 ℃下反应30 min,取出纳米纤维膜用醋酸-醋酸钠缓冲液清洗,然后再加入到新的相同愈创木酚反应液中,在相同条件下重复反应,以首次使用时酶活性为100%,测定每次重复使用后酶相对活性.

1.6 形态及结构表征

(1) 纳米纤维膜形态观察.在真空状态下,对待测的纳米纤维膜表面进行喷金处理,采用扫描电子显微镜观察纤维的表面形态.

(2) 纳米纤维膜红外光谱分析.采用溴化钾压片制样法对 PAN 纳米纤维膜、AOPAN纳米纤维膜进行红外光谱分析.

2 结果与讨论

2.1 AOPAN纳米纤维膜表征

2.1.1 纳米纤维膜形貌分析

通过扫描电子显微镜观察PAN纳米纤维膜在偕胺肟化改性前后表面形态变化,其结果如图3所示.由图3(a)可知,静电纺丝制备的PAN 纳米纤维膜是由随机排列的纳米纤维组成,纤维成型良好,直径较为均一;由图3(b)可知,偕胺肟化改性制备的AOPAN纳米纤维(转化率为32.8%)依然保持良好的形态,纤维直径均匀,且结构并没有发生明显的变化,但其表面变得有些粗糙.

(a) PAN

2.1.2 纳米纤维膜红外光谱分析

图4 PAN和AOPAN纳米纤维膜红外光谱图Fig.4 Infrared spectroscopy of the PAN and AOPAN nanofibrous membrane

2.2 交联条件对固定漆酶的影响

2.2.1 戊二醛质量分数对固定漆酶的影响

准确称取7组0.01 g AOPAN纳米纤维膜放于样品瓶中,加入20 mL质量分数为1%～7%的戊二醛溶液,在25 ℃、40 rad/min条件下慢速振荡10 h,取出纳米纤维膜用蒸馏水洗去多余戊二醛,分别放入50 mL、3 g/L的漆酶溶液中,在4 ℃下固定12 h.然后分别测试不同条件下的漆酶固定量及酶活性,以游离漆酶活性为100%,用固定化酶相对活性表示漆酶活性,每组试验测试3次,求平均值,结果如图5所示.由图5可以看出,随着戊二醛质量分数的增加,漆酶的固定量也在逐渐增加,固定化酶的活性大致保持不变;当戊二醛的质量分数达到5%时,漆酶固定量达到最大值(73.64 mg/g,干重),再继续增加戊二醛,漆酶的固定量开始出现下降,固定化漆酶的活性也开始下降.

2.2.2 戊二醛反应时间对固定漆酶的影响

图5 戊二醛质量分数与酶固定量和酶相对活性关系Fig.5 Relationship between the mass fraction of glutaraldehyde and the amount of enzyme and relative activity of enzyme

准确称取7组0.01 g AOPAN纳米纤维膜放于样品瓶中,加入20 mL质量分数为5%的戊二醛溶液,在25 ℃、40 rad/min条件下振荡不同时间,然后用蒸馏水洗去多余戊二醛,之后与2.2.1节操作相同,结果如图6所示.由图6可以看出,随着戊二醛处理时间的延长,酶固定量在逐渐增加,固定化酶的相对活性变化不大,当处理时间为10 h时,酶固定量达到最大,再延长处理时间,酶的固定量和酶的活性开始变小.因为AOPAN纳米纤维膜上的氨基与戊二醛一端的醛基反应需要一定时间[11],反应10 h时效果最好,如果再增加反应时间会引发副反应,从而降低酶固定量和固定化酶活性.

图6 处理时间与酶固定量和酶相对活性关系Fig.6 Relationship between treatment time and the relative activity of enzyme and amount of enzyme

2.3 AOPAN纳米纤维膜固定化漆酶动力学分析

通过测定酶催化反应中的米氏常数能够很好地解释酶促反应现象.用Lineweaver-Burk双倒数法可求解动力学参数,即将米氏方程变为倒数形式,如式(3)所示.

(3)

式中:v0为初始反应速率;[S]为底物浓度;Km为米氏常数,在固定化酶中,Km也体现了酶与固定化载体间的亲和性;vmax为酶在底物过量时的最大反应速率.

在醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值为4.5)于50 ℃条件下测试动力学参数,以愈创木酚为反应底物,底物浓度在0.5～10 mmol/L之间变化,反应30 min,分别测定游离漆酶与固定化漆酶的最大反应速率,测试结果如表1所示.

表1 游离漆酶和固定化漆酶的动力学参数Table 1 Kinetic parameters of free laccase and immobilized laccase

与游离漆酶相比,漆酶经AOPAN纳米纤维膜固定化后,其米氏常数Km值有所增加,表示漆酶与底物的亲和性有所下降,但相对其他载体固定化漆酶而言,其仍体现出与载体良好的亲和性[12].另外,漆酶的构象虽然因为交联而受到约束,但其vmax值降低较小.

2.4 固定化漆酶的性能

2.4.1 最适反应温度和pH值

漆酶作为一种高效生物催化剂,其活性很容易受到环境中的酸碱度和温度的影响,在不同温度和pH值的条件下,分别对游离漆酶和固定化漆酶进行酶活性测试,测试结果如图7所示.由图7(a)可知,游离漆酶的最适pH值为4.5,而固定化漆酶的最适pH值为4.0,而且固定化漆酶对于pH值的变化其性能更稳定.这是因为AOPAN纳米纤维膜经交联法固定化漆酶使其构像更加稳定,当 pH 值在一定范围内变化时,体现出比游离漆酶更稳定的催化性能.由图7(b)可知,固定化漆酶的最适温度为55 ℃,较游离漆酶上升5 ℃,并且从整体上看,固定化漆酶对温度变化表现出更好的稳定性.这是因为通过交联法固定化酶时,酶大分子与戊二醛交联的纳米纤维形成多点连接,从而在一定程度上稳定了漆酶的构象,能防止酶因受热而发生肽链折叠及伸展变形而影响酶的活性[13].

(a) pH值

(b) 温度图7 游离漆酶和固定化漆酶的相对活性与pH值和温度关系Fig.7 Relationship between the relative activity of free laccase and immobilized laccase with pH value and temperature

2.4.2 固定化漆酶的稳定性

本文主要从固定化漆酶的重复使用能力和储存能力来研究固定化漆酶的稳定性.当固定化漆酶在pH值为4.5、温度为50 ℃的条件下,前5次重复使用中,酶相对活性一直保持在85%以上;当固定化漆酶在相同条件下重复使用10次时,其相对活性保持在65.7%以上.由此表明,AOPAN纳米纤维膜固定化漆酶具有良好的重复使用能力.游离漆酶和固定化漆酶的储存稳定性对比如图8所示.

图8 游离漆酶与固定化漆酶的储存稳定性对比Fig.8 Storage stability of free laccase and immobilized laccase

由图8可知,游离漆酶在4 ℃下储存20 d以后,其相对活性只有35.5%左右,然而在同样条件下,固定化漆酶相对活性还保持在63.6%以上,说明固定化漆酶具有良好的储存稳定性.因为交联法固定化漆酶形成的碳氮双键使漆酶的结构更加稳定,漆酶的性能变得更稳定[14].

3 结 语

本文以AOPAN纳米纤维膜为载体通过戊二醛交联固定漆酶,当戊二醛质量分数为5%,反应时间为10 h时,固定漆酶效果最好,漆酶的固定量达到73.64 mg/g,而且此时漆酶的相对活性也达到最大.

通过测试固定化漆酶与游离漆酶的性能发现,随着反应温度及pH值的变化,固定化漆酶体现出更好的稳定性.动力学分析结果也表明,AOPAN纳米纤维膜载体与漆酶之间具有良好的生物亲和性.试验结果同时表明,固定化漆酶经10次重复使用,其相对活性能保持在65.7%以上,固定化漆酶在4 ℃条件下储存20 d后,其相对活性还能保持在 63.6%以上,而游离漆酶在相同条件下只保留35.5%的活性.

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Study on Preparation of AOPAN Nanofibrous Membrane and Its Immobilized Laccase

WUDing-sheng,FENGQuan,WEIAn-fang,LIXin,JIANGYin-guo

(Anhui Provincial Key Laboratory of Textile Fabric,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Amidoxime ployarcylonitrile(AOPAN) nanofibrous membrane was prepared by electrospinning and amidoxime modification. Glutaraldehyde was used as a coupling agent,as its both ends of the aldehyde groups reacted with amino groups of AOPAN nanofibrous membrane and laccase,respectively,in this way using for enzyme immobilization. The relationship between the condition of glutaraldehyde cross-linked and the immobilized laccase was studied,and the relative properties of the immobilized laccase were also determined. Results show that when the mass fraction of glutaraldehyde is 5%,the processing time is 10 h,the immobilized laccase has the best effect. The kinetics analysis of free laccase and immobilized laccase show that the immobilized enzyme and substrate affinity is excellent. Compared with free laccase,the immobilized laccase show a better stability for the change of temperature and pH value,it also has good storage stability and reusability. The immobilized laccase can be kept for 20 d at 4 ℃,and the relative activity of enzyme can be maintained more than 63.6%,and the relative activity of enzyme can be kept more than 65.7% after repeated use 10 times.

amidoxime modification;amidoxime polyarcylonitrile(AOPAN) nanofiber;immobilized laccase;glutaraldehyde crosslinking

1671-0444 (2016)05-0693-06

2016-03-02

国家自然科学基金资助项目(21377004)；安徽省自然科学基金资助项目(1408085ME87)；安徽省高校自然科学研究资助项目(KJ2016SD04，KJ2015A022)；安徽省高校优秀青年人才支持计划资助项目

武丁胜(1989—)，男，安徽阜阳人，硕士研究生，研究方向为功能性纺织品的开发.E-mail: wudingsheng282@126.com 凤 权(联系人)，男，副教授，E-mail: fengquan@ahpu.edu.cn

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