肾穿刺活检组织病理诊断中六胺银染色的改进

傅杭州 方庆全

肾穿刺活检组织病理诊断中六胺银染色的改进

傅杭州 方庆全

目的 探讨肾穿刺活检组织病理诊断中六胺银染色染液配制法与染色方法改进的可行性。方法 收集厦门大学附属第一医院病理科2014年1月～2015年12月确诊的60例肾穿刺活检病例的蜡块，每例蜡块均连续切片3片，随机分为3组。A组使用传统六胺银染液用传统染色法染色，B组使用改进六胺银染液用传统染色法染色，C组使用改进六胺银染液用改进染色法染色，以百分制评定180张六胺银染色片的得分，统计各组的得分，结果采用（x-±s）表示，采用独立样本t检验进行比较，分析各组的得分差异是否有统计学意义。结果 B组染色得分高于A组染色得分（82．3±10．4 vs． 68．3±9．8，t=7．592，P＜0．001）；C组染色得分高于B组染色法得分（93．6±6．7 vs． 82．3±10．4，t=7．076，P＜0．001）。结论 改进六胺银染液配制方法及改进其染色方法，结果显示基底膜、网状纤维呈黑色，且界限清晰，免疫复合物呈红色，细胞核呈蓝色，背景粉红色，清晰无杂质，优于传统方法。

肾穿刺活检组织；六胺银染色；改进

医学发展的历史证明，仅从临床症状和检验指征进行疾病的诊断和治疗，存在一定的缺陷和局限性。将病变的器官或组织通过病理形态学方法，客观地展现于医生的视野，必能使其思维得以升华，进而为其诊断和治疗奠定坚实的基础，所以，肾活检的病理诊断在肾脏病学的发展历程中，起到了不可估量的作用［1］。肾穿刺活检组织病理诊断中，六胺银染色法是重要的检查方法，能清晰的显示基底膜增厚“叮突”、“双轨”等病理变化，还可以观察肾小球毛细血管或球囊壁基底膜在炎性损伤中的形态学改变［2］，因此在肾穿刺活检组织病理诊断中具有极为重要的意义。但临床实践中发现，传统方法配制的六胺银工作液常染色效果不理想，传统的六胺银染色法染色效果不佳，笔者对六胺银工作液的配制方法进行了一些改进，对传统染色法也进行了一些改进，均取得很好的效果。

1 资料与方法

1.1 资料

收集厦门大学附属第一医院病理科2014年1月～2015年12月确诊的60例肾穿刺活检病例的蜡块，每例蜡块均连续切片3片，随机分为3组。

1.2 方法

1.2.1 传统六胺银染液配制法 取0.5 ml的5%硝酸银溶液缓慢加入到10 ml的3%六次甲基四胺水溶液中，随即形成乳白色沉淀，摇动沉淀即溶解变清。再加入5%四硼酸钠水溶液2 ml，混匀，加入蒸馏水25 ml，混匀后即可使用［3］。

1.2.2 改进六胺银染液配制法 2%六次甲基四胺水溶液10 ml，加入5%四硼酸钠溶液2 ml，加入2%硝酸银水溶液10 ml，震荡至乳白色悬浊液变为清亮透明，加入30 ml蒸馏水，混匀后过滤立即使用。

1.2.3 传统六胺银染色法 （1）切片厚1～2 µm；（2）常规脱蜡至水；（3）0.5%高碘酸溶液氧化15 min，水洗5 min；（4）8%铬酸氧化30 min，流水稍洗；（5）1%偏重亚硫酸钠处理1 min，流水冲洗5 min，蒸馏水洗；（6）放入预热至60℃的六胺银工作液作用30～60 min，见到切片在黄棕色的背景中有黑色反应时，取出切片，蒸馏水洗后镜下检查（以肾小球毛细血管基底膜出现清晰可见的黑色银沉淀为准），如果着色深度不够，可放回六胺银工作液继续染色；（7）蒸馏水洗后，0.1%氯化金溶液调色1～3 min；（8）蒸馏水稍洗后，硫代硫酸钠液处理3 min，自来水冲洗5 min。（9）HE浅染3 min，分化，还蓝。（10）各级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固［3］。

1.2.4 改进的六胺银染色法 （1）切片厚1～2 µm；（2）脱蜡至水后放入60℃的Bouin固定液中1 h，流水冲洗至黄色褪去；（3） 2%高碘酸溶液氧化15 min，水洗；（4）8%铬酸氧化30 min，流水稍洗；（5）1%偏重亚硫酸钠处理1 min，流水冲洗5 min，蒸馏水洗；（6）放入预热至65℃的六胺银工作液作用30～40 min，见到切片在黄棕色的背景中有黑色反应时，取出切片，蒸馏水洗后镜下检查，或者25 min后每3 min取出切片1次，蒸馏水洗后用显微镜观察，直至肾小球毛细血管基底膜出现清晰可见的黑色银沉淀为止，如果着色深度不够，可放回六胺银工作液继续染色；（7）蒸馏水洗后，0.1%氯化金溶液调色1～3 min；（8）蒸馏水稍洗后，硫代硫酸钠液处理、水洗、对比染色、脱水、透明、封固等操作步骤同传统六胺银染色法［2］。

1.2.5 染色 A组：使用传统六胺银染液用传统染色法染色；B组：使用改进六胺银染液用传统染色法染色；C组：使用改进六胺银染液用改进染色法染色。

1.2.6 评片 切片由2名副主任医师双盲评片，每片进行百分制评分。

1.3 统计学分析

2 结果

B组染色得分高于A组染液染色得分（82.3±10.4 vs. 68.3±9.8），t=7.592，P＜0.001。C组染色得分高于B组染色法得分（93.6±6.7 vs. 82.3±10.4），t=7.076，P＜0.001。

3 讨论

改进的六胺银染液染色结果显示基底膜、网状纤维呈黑色，免疫复合物呈红色，细胞核呈蓝色，背景粉红色，清晰无杂质；而传统的六胺银染液染色结果基底膜常染色过深或过浅，易产生基底膜增厚的假象，背景易出现银颗粒杂质。改进的六胺银染液配制时省去配制六胺银贮备液的步骤，亦省去储存贮备液的步骤，试剂现配现用，提高了试剂的稳定性。改进的染液降低了六次甲基四胺水溶液和硝酸银溶液的溶度，使切片在银染色时更易控制，可有效地避免银染色过深、染色过浅或银颗粒沉积。改进染液还在六次甲基四胺与硝酸银反应之前，先在六次甲基四胺水溶液中加入四硼酸钠溶液，使六次甲基四胺碱化后再加入硝酸银，碱化的六次甲基四胺螯合银离子的稳定性被削弱，使银离子更易被游离的醛基还原成棕黑色的沉淀，因此染色效果更佳。

病理常规切片厚度多为3～4 µm，而肾穿刺活检组织六胺银染色的切片厚度以1～2 µm为宜，切片太厚不宜观察基底膜病变和组织结构。因Bouin固定液对肾组织固定效果更好，所以作者在切片脱蜡至水后，将切片放入60℃的Bouin固定液中补充固定1 h，提高了染色效果。因为基底膜富含黏多糖，必须经过充分氧化才能使醛基暴露完全，醛基把六胺银还原为黑色的金属银［4］，若氧化不够或不完全，将导致切片染色较浅，影响染色结果的判断，所以笔者将高碘酸的溶度由0.5%提高至2%，以确保充分氧化。

六胺银工作液的染色步骤至关重要，作者经实践发现，将六胺银工作液作用温度由传统的60℃改为65℃，改进染色法染色时间缩短，组织结构更清晰，对比度更强。六胺银染色为进行性银浸染，所以作者见到切片在黄棕色的背景中有黑色反应时，取出切片，蒸馏水洗后镜下检查，或者在六胺银工作液作用25 min后每3 min显微镜观察1次，如着色不够深，可用蒸馏水冲洗后再放回六胺银工作液中继续作用。肾小管基底膜一般比肾血管球基底膜显色早，但以肾小球毛细血管基底膜出现黑色的银沉淀为标准，血管球基底膜呈黑色而背景呈棕黄色为宜。

氯化金溶液调色步骤往往不被重视，传统染色法简单地介绍调色2 min，而调色应以切片呈灰色，基底膜呈黑色为宜。如处理不足则在切片内有大量未显色的红棕色残存物，如果调色过度，组织将有红色色调，影响对基底膜等纤细结构的分辨。作者建议调色也应在调色1 min后，在显微镜观察下控制，以达到最佳效果。

笔者通过对比实验，发现改进六胺银染液配制方法及改进其染色方法，结果显示基底膜、网状纤维呈黑色，且界限清晰，免疫复合物呈红色，细胞核呈蓝色，背景粉红色，清晰无杂质，优于传统方法。

［1］ 邹万忠． 肾活检病理学［M］． 北京：北京大学医学出版社，2006：71-107．

［2］ 钟纬经，康凯夫． 改良PASM染色法在肾穿刺活检组织中的应用［J］． 诊断病理学杂志，2015，22（1）：63．

［3］ 中华医学会． 临床技术操作规范病理学分册［M］． 北京：人民军医出版社，2010：169-170．

［4］ 戚晓东． 肾小球基底膜PAMS染色方法的应用体会［J］． 诊断病理学杂志，2012，19（2）：159．

Histopathological Diagnosis of Renal Biopsy Hexamine Silver Stain Improvement

FU Hangzhou FANG Qingquan Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen Fujian 361003，China

Objective To explore the histopathological diagnosis of renal biopsy hexamine silver dyeing dye solution preparation method and the feasibility of improvement methods． Methods Collected in first affiliated hospital of xiamen university from January 2014 to December 2015，60 cases of renal biopsy diagnosis of wax，each wax from 60 cases of renal biopsy diagnosis all were cut into serial sections of three and randomly divided into three groups． group A was dyed by traditional hexamine silver dye solution under the traditional dyeing method，group B，which also under the traditional dyeing method，was dyed with improved hexamine silver dye solution． Under the improved dyeing method，group C was dyed with improved hexamine silver dye solution，scores of the groups（out of a possible 100）that were 180 pieces of hexamine silver staining sections，were presented in the form of（x-±s）．Compared with the independent sample t-test，to analyze the statistical significance of the differences in each group’s scores． Results Group B had got significantly higher scores than group A（82．3±10．4 vs． 68．3±9．8，t=7．592，P＜0．001）． While the scores of group C were much higher than group B（93．6±6．7 vs． 82．3±10．4，t=7．076，P＜0．001）． Conclusion Under the improved hexamine silver dye solution preparation method and improved its dyeing method，the result shows that the basement membrane，reticular fiber in black，and clear boundaries，immune complex red，thenuclei are blue，pink background，clear and without impurities，in conclusion，the improved hexamine silver dye solution preparation method and improved dyeing method is significantly better than the traditional method．

Renal biopsy tissue，Hexamine silver stain，Improvement

R361

A

1674-9316（2016）19-0160-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．19．108

厦门大学附属第一医院病理科，福建 厦门 361003