ADC患者体内HIV⁃1 gp120基因的变异及其对U87细胞合成PDGF⁃BB与MCP⁃1的影响

秦泽明 刘建伟 苏祥 李昕 杨奕 温红玲 宋艳艳 黄涛 赵丽

250012济南，山东大学公共卫生学院卫生微生物检验室（秦泽明、刘建伟、李昕、温红玲、宋艳艳、赵丽）；山东省滕州市中心人民医院（苏祥）；山东大学齐鲁医院卫计委和教育部心血管重构与功能研究重点实验室转译心血管医学国家和山东省联合重点实验室（杨奕）；山东省疾病预防控制中心艾滋病防制所（黄涛）

ADC患者体内HIV⁃1 gp120基因的变异及其对U87细胞合成PDGF⁃BB与MCP⁃1的影响

秦泽明 刘建伟 苏祥 李昕 杨奕 温红玲 宋艳艳 黄涛 赵丽

250012济南，山东大学公共卫生学院卫生微生物检验室（秦泽明、刘建伟、李昕、温红玲、宋艳艳、赵丽）；山东省滕州市中心人民医院（苏祥）；山东大学齐鲁医院卫计委和教育部心血管重构与功能研究重点实验室转译心血管医学国家和山东省联合重点实验室（杨奕）；山东省疾病预防控制中心艾滋病防制所（黄涛）

目的探讨HIV⁃1gp120在HIV⁃1入侵中枢神经系统（CNS）机制中的作用。方法扩增1例艾滋病痴呆综合征（ADC）病人外周主动脉周淋巴结（PL）和CNS颞叶灰白质连接处（TGWJ）、脑室周围组织（PV）的HIV⁃1 gp120基因，测序并进行序列分析；构建真核表达载体pEGFP⁃gp120，在U87细胞中表达gp120蛋白，观察绿色荧光蛋白荧光强弱判断gp120表达；同时用免疫组化方法检测蛋白的表达，ELISA法检测U87细胞中血小板衍生生长因子BB（PDGF⁃BB）和单核细胞趋化蛋白⁃1（MCP⁃1）的含量。结果gp120基因序列分析结果表明，三个部位的HIV⁃1均为巨噬细胞嗜性，CNS来源的TGWJ和PV的HIV⁃1使用CCR5受体，与神经致病性有关。成功构建pEGFP⁃gp120表达载体，并在U87细胞中表达了gp120蛋白，转染后48 h蛋白表达量最高。ADC病人不同部位来源的gp120蛋白对U87细胞PDGF⁃BB水平无影响（P＞0.05），但能增强其MCP⁃1的分泌水平，且来自外周PL的gp120对MCP⁃1的升高作用较CNS更显著（P＜0.05）。结论ADC病人CNS gp120的变异提高了其对CNS环境的适应能力，与HIV的神经致病性有关；gp120蛋白可刺激U87细胞分泌MCP⁃1，而且外周来源的gp120作用较强，利于HIV⁃1入侵CNS。

人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1，HIV⁃1）可以入侵中枢神经系统（central nervous system，CNS）引起一系列神经行为异常，发展为HIV相关认知障碍，其中最严重的是艾滋病痴呆综合征（AIDS dementia complex，ADC），在HIV感染者中约占2%⁃8%［1］。HIV在感染早期即可入侵CNS，其机制目前尚不清楚。生理状态下，血脑屏障（blood brain barrier，BBB）能保护大脑不受外周血中有毒有害物质损害和病原体入侵，其通透性受多种因素影响，包括自由基、血管活性物质、细胞因子、一氧化氮、酶、水通道蛋白等［2］。血小板衍生生长因子BB（platelet⁃derived growth factor⁃BB，PDGF⁃BB）和单核细胞趋化蛋白⁃1（monocyte chemoattractant protein⁃1，MCP⁃1）可在星形胶质细胞中合成，影响BBB的通透性，促进HIV进入CNS。ADC患者体内的HIV⁃1具有较强的神经致病性，其包膜糖蛋白gp120基因高度变异，这些变异是否影响胶质细胞中PDGF⁃BB和MCP⁃1两种细胞因子的合成，从而影响BBB的通透性，尚未见报道。本研究将一例ADC病人不同部位来源的HIV⁃1gp120（333⁃1149nt）在人胶质瘤细胞U87中表达，研究了gp120蛋白对U87细胞分泌PDGF⁃BB和MCP⁃1的影响，为研究HIV⁃1神经致病机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料ADC病人HIV⁃1 gp120基因由本室克隆并保存［3］。PCR扩增HIV⁃1 gp120（333⁃1149nt）基因，上游引物：5′⁃CCCAAGCTTATGTTATGGGAT CAAAGCC⁃3′（划线序列为Hind III酶切位点），下游引物：5′⁃CGGAATTCGATGATGATGATGATGGTG GAAAAATTCCCCTCCACAAT⁃3′（划线序列分别为EcoR I酶切位点和his标签），由上海生工生物工程有限公司合成。pMD⁃19T和pEGFP⁃N1载体由本室保存。抗gp120单克隆抗体为Santa Cruz公司产品。PDGF⁃BB ELISA检测试剂盒为武汉华美生物工程有限公司产品。MCP⁃1 ELISA试剂盒为上海依科赛生物制品有限公司产品。

1.2 HIV⁃1 gp120基因克隆及序列分析

1.2.1 基因克隆：以ADC患者主动脉周淋巴结（periaortic lymphoid，PL），颞叶灰白质连接处（temporal gray／white matter junction，TGWJ），脑室周围组织（periventricular tissue，PV）三个部位的HIV⁃1 gp120全长基因克隆作模板，扩增HIV⁃1gp120（333⁃1149 nt）。PCR体系：模板1 μl，上下游引物各1 μl，Ex Taq 0.25 μl，dNTP 4 μl，10x buffer 5 μl，去离子水补充至50 μl。反应条件：95℃，预变性5 min；（95℃30 s，55℃30 s，72℃60 s）×30个循环；72℃延伸10 min。扩增的长度为798 bp。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，回收纯化后，与克隆载体pMD⁃19T连接，转化感受态细胞DH5ɑ，经氨苄青霉素及α⁃互补篮白斑筛选阳性克隆，增菌后测序，获得pMD⁃19T⁃gp120克隆。

1.2.2 序列分析：将三个部位的gp120序列及HIV标准株HXB2.0的gp120序列使用NCBI网站的在线工具BLAST进行序列比对，使用MEGA 4软件绘制系统发育树。

1.3 HIV⁃1 gp120真核表达载体的构建pMD⁃19T⁃gp120和表达载体pEGFP⁃N1用Hind III和EcoR I双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因和pEGFP⁃N1（约4.7 kb），T4连接酶连接后转化感受态细胞DH5ɑ，经卡那霉素筛选阳性菌落，增菌后测序，获得PL、TGWJ、PV来源的pEGFP⁃gp120三个表达载体。

1.4 HIV⁃1 gp120蛋白在U87细胞中表达及对U87细胞合成PDGF⁃BB、MCP⁃1的影响

1.4.1 gp120在U87细胞中表达：将上述三个表达载体用脂质体法分别转染U87，同时设对照组（空载体pEGFP对照和空白对照）。转染后分别在24 h、36 h、48 h、60 h、72 h观察荧光。荧光强度最强时用免疫组化方法检测gp120蛋白表达，并用Meta Morph软件进行定量分析。

1.4.2 gp120蛋白对U87细胞合成PDGF⁃BB、MCP⁃1的影响：重组质粒转染U87细胞后48 h收集细胞及培养液。培养液5 000 g、4℃离心5 min，取上清用于检测MCP⁃1。细胞经胰酶消化后，用PBS收集于离心管中，2 000 g离心10 min，PBS重悬细胞，经三次冻融裂解后，13 000 g、4℃离心20 min，取上清用于检测PDGF⁃BB。分别用ELISA试剂盒检测PDGF⁃BB、MCP⁃1含量，实验重复三次。

1.5 统计学方法所有数据采用SPSS20软件进行统计分析。PDGF⁃BB、MCP⁃1含量及免疫组化定量结果分析均采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIV⁃1 gp120基因克隆PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，在798bp处有一明显条带，与预期大小相符。与pMD⁃19T载体连接，测序结果证实为HIV⁃1 gp120，成功构建pMD⁃19T⁃gp120克隆载体。

2.2 HIV⁃1 gp120进化树经BLAST比对确定三段gp120序列均为HIV⁃1 B亚型。系统进化树见图1，由图1可知，分离自TGWJ、PV的gp120基因和分离自PL的gp120基因处在不同进化枝上。

图1 分离自1例ADC患者不同组织的HIV⁃1 gp120的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of HIV⁃1 gp120 genes isolated from different tissues of the ADC patient

2.3 不同来源HIV⁃1 gp120 V3区氨基酸序列比较

PL的顶端四肽为APGS，TGWJ和PV的顶端四肽为GPGR。V3的第11⁃25位氨基酸序列S／GXXXGPGXXXXXXXE／D是预测HIV⁃1毒株细胞嗜性、合胞体诱导型及使用辅助受体CCR5的共同基序，这些位点变化可以改变病毒的表型。TGWJ、PV的辅助受体预测序列为SIPIGPGRAPLYATGE和 GIPIGPGRAPLYATGE，以CCR5为辅助受体。PL无上述相应序列，无法推断辅助受体使用类型。PL、TGWJ、PV的V3第11位氨基酸为S／G，第25位为D／E，均为巨噬细胞嗜性、非合胞体诱导型。

2.4 HIV⁃1 gp120真核表达载体的构建将gp120基因和pEGFP⁃N1表达载体成功连接，构建了pEGFP⁃gp120（PL）、pEGFP⁃gp120（TGWJ）、pEGFP⁃gp120（PV）表达载体。

2.5 HIV⁃1 gp120蛋白在U87细胞中的表达将上述三种表达载体转染U87后分别在24 h、36 h、48 h、60 h、72 h观察到荧光。随时间延长，带绿色荧光的细胞逐渐增多，48 h时绿色荧光最强，至72 h时有所减少；48 h绿色荧光见图2。空白对照无绿色荧光。转染后48 h的免疫组化法检测结果见图3，pEGFP⁃gp120转染组细胞中均可见清晰的棕色颗粒，空载体对照未见棕色颗粒，表明U87细胞中成功表达HIV⁃1 gp120蛋白，平均积分光密度值在144.601⁃148.900之间，差异无统计学意义（P＞0.05）。

P：空载体对照图2 重组质粒转染U87细胞48 h HIV⁃1 gp120的表达（100×）P：Plasmid controlFig.2 Expression of HIV⁃1 gp120 at 48 h after the transfection of recombinant plasmids into U87 cells（100×）

2.6 HIV⁃1 gp120蛋白对U87细胞表达PEGF⁃BB和分泌MCP⁃1的影响pEGFP⁃gp120重组质粒转染U87细胞后48 h各组细胞和上清分别检测到不同浓度的PEGF⁃BB和MCP⁃1，PDGF⁃BB标准曲线的相关系数和回归方程分别为r＝0.998，y＝1519.4x－17.368。MCP⁃1标准曲线的相关系数和回归方程为分别为r＝0.997，y＝503.52x－61.209。两种细胞因子检测结果见图4。结果显示，PDGF⁃BB浓度在各组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。MCP⁃1浓度在空白组和pEGFP组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。与pEGFP组相比，PL、TGWJ和PV组的MCP⁃1浓度均有升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。PL、TGWJ和PV组间两两比较结果显示，MCP⁃1浓度PL＞TGWJ＞PV组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

P：空载体对照图3 免疫组化法检测HIV⁃1 gp120在U87中表达（100×）P：Plasmid controlFig.3 Detection of expression of HIV⁃1 gp120 protein in U87 cell by immunohistochemical assay（100×）

3 讨论

HIV⁃1属于逆转录病毒，具有高度变异的特性。CNS独特的环境导致了CNS中的HIV⁃1基因变异不同于外周［4］。在外周HIV⁃1的靶细胞以CD4＋T细胞为主，在CNS以巨噬细胞和小胶质细胞为主。与CD4＋T细胞相比，巨噬细胞和小胶质细胞表达CD4水平较低，CNS中的HIV⁃1对CD4的依赖性降低。HIV gp120是病毒与受体结合部位，特别是V3区，决定辅助受体使用类型和细胞嗜性。本研究中的ADC病人不同部位来源的三个gp120（111⁃383aa）中，来自CNS的两个处于进化树的同一分支，来自外周的处在另一分支，外周与CNS之间的差异比CNS内的差异大，表明不同部位的HIV⁃1变异存在区室化。三个gp120代表的HIV⁃1均为巨噬细胞嗜性，非合胞体诱导型，CNS来源的两个HIV⁃1使用CCR5受体，表明变异提高了其对CNS环境的适应能力，与HIV⁃1的神经致病性有关。

HIV⁃1通过BBB的机制有多种学说，目前比较公认的是单核／巨噬细胞入侵假说，即HIV⁃1感染的单核／巨噬细胞产生的促炎因子和HIV⁃1的某些蛋白对内皮细胞有毒性作用，破坏BBB，并刺激星形胶质细胞等分泌多种细胞因子，促使单核／巨噬细胞进入CNS，从而将病毒带入大脑［5］。星形胶质细胞可以被HIV⁃1感染并成为其蓄积场所［6］。同时，星形胶质细胞通过合成PDGF⁃BB、MCP⁃1等多种细胞因子调节BBB的通透性［7，8］，而且MCP⁃1还可以募集外周血中被HIV⁃1感染的单核细胞聚集在毛细血管周围，促进HIV入侵CNS［8，9］。

图4 转染后48 h U87细胞合成细胞因子的浓度A：PDGF⁃BB；B：MCP⁃1Fig.4 Concentration of PDGF⁃BB and MCP⁃1 in U87 cell after transfection at 48 h

研究证实，gp120蛋白可作用于CNS血管内皮细胞使BBB通透性增加，募集外周HIV⁃1感染的单核细胞穿过BBB［10］。Bethel⁃Brown等利用HIVgp120包装假病毒，证实gp120可使人星形胶质细胞系A172中PDGF⁃BB含量升高，由此引起的MCP⁃1分泌升高［8］。所有这些研究采用非ADC病人外周来源的gp120蛋白，而ADC病人体内的HIV具有明显的神经致病性，gp120氨基酸位点的变异对其神经毒性的影响尚未见报道。本研究选取ADC病人CNS和外周三部位来源的gp120（111⁃383aa），探讨其对U87细胞分泌PDGF⁃BB和MCP⁃1的影响，结果显示，三个部位的gp120蛋白对U87 PDGF⁃BB水平无影响，但可以使MCP⁃1水平升高，与Bethel⁃Brown等报道不同，其原因可能是：MCP⁃1的表达受多种因素调节，在转录水平上，近端调控区主要由PDGF⁃BB和干扰素（IFN⁃γ）调控，远端调控区与NFκB结合，受肿瘤坏死因子（TNF）诱导［11⁃13］。gp120蛋白可使U87细胞分泌TNF⁃α升高［14］，通过远端调控区使MCP⁃1的表达增强。另外，与Bethel⁃Brown报道不同，本研究使用U87细胞系，是否gp120蛋白在不同细胞中的作用机制不同仍待进一步研究。本研究中不同来源的gp120引起MCP⁃1升高的能力不同，这可能与gp120氨基酸变异有关，具体原因有待进一步研究。

总之，ADC病人体内HIV⁃1 gp120能增强U87中MCP⁃1的分泌，利于HIV⁃1入侵CNS。但是，不同部位来源的HIV⁃1 gp120作用强度不同，这种差异与gp120关键氨基酸位点的关系待进一步研究。

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Impact of the variation of HIV⁃1 gp120 genes derived from an ADC patient on the synthesis of PDGF⁃BB and MCP⁃1 in U87 cells

Qin Zeming，Liu Jianwei，Su Xiang，Li Xin，Yang Yi，Wen Hongling，Song Yanyan，Huang Tao，Zhao Li

Department of Laboratory science of microbiology，School of Public Health，Shandong University，Jinan 250012，China（Qin ZM，liu JW，Li X，Wen HL，Song YY，Zhao L）；Tengzhou Central People’s Hospital（Su X）；The Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Function Research，Chinese Ministry of Education and Chinese Ministry of Health，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China（Yang Y）；Department of AIDS Prevention and Control Center，Shandong Center for Disease Control and Prevention，Jinan 250012，China（Hao T）．

Zhao Li，Email：dlzhl＠sdu．edu．cn

ObjectiveTo study the function of gp120 in the mechanism of invasion of HIV⁃1 into the central nervous system（CNS）.MethodsHIV⁃1 gp120 genes were amplified from periaortic lymphoid（PL），temporal gray／white matter junction（TGWJ）and periventricular tissue（PV）in an AIDS dementia complex（ADC）patient，sequenced and analyzed.We conducted an eukaryotic expression plasmid pEGFP⁃gp120，expressed the gp120 protein in U87 cells，observed the fluorescence intensity of GFP to judge expression of the protein，detected gp120 protein by immunohistochemical assay，and the concentration ofplatelet⁃derived growth factor⁃BB（PDGF⁃BB）and monocyte chemoattractant protein⁃1（MCP⁃1）were assessed by ELISA.ResultsAll the gp120 involved in the study were macrophage⁃tropic.Gp120 derived from HIV⁃1 in CNS were CCR5⁃using，which correlate with nervous pathogenicity.The expression plasmid pEGFP⁃gp120 was conducted successfully，gp120 proteins were expressed in U87 cells，and the expression level reached the highest at 48 h after transfection.There was no significant difference among the levels of PDGF⁃BB under the expression of gp120 deprived from different tissues（P＞0.05），but the levels of MCP⁃1 had been elevated，especially the PL group（P＜0.05）.ConclusionsHIV⁃1 gp120 protein from ADC patient can elevate the level of MCP⁃1 in U87 cells，especially the gp120 from peripheral tissues，which can promote the invasion of HIV⁃1 into CNS.

AIDS dementia complex；gp120；platelet⁃derived growth factor⁃BB；monocyte chemoattractant protein⁃1；glioblastoma cell line U87

赵丽，Email：dlzhl＠sdu.edu.cn

10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2016.06.000

艾滋病痴呆综合征；HIV⁃1 gp120；血小板衍生生长因子BB；单核细胞趋化蛋白⁃1；胶质瘤细胞U87

山东省科技发展计划（2007GG30002003）

2016⁃09⁃19）