人巨细胞病毒感染与孕妇脐血ADAMTS13蛋白酶活性相关性研究

闫珺 徐亚辉 刘侃 武海英

450000郑州，河南省人民医院产科

人巨细胞病毒感染与孕妇脐血ADAMTS13蛋白酶活性相关性研究

闫珺 徐亚辉 刘侃 武海英

450000郑州，河南省人民医院产科

目的研究人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）感染与晚孕妇女脐血血管性血友病因子裂解蛋白（ADAMTS13）活性的相关性。方法选择2014年10月⁃2015年10月在河南省人民医院产科住院分娩的470例健康晚孕孕妇，于分娩时采集脐血，PCR法检测脐血HCMV DNA和mRNA水平，残余胶原结合试验法检测脐血中ADAMTS13的活性，ELISA法检测脐血血友病因子（vWF）抗原水平。结果470例孕晚期孕妇中，脐血HCMV DNA阳性率7.65%（36／470），其中21例HCMV mRNA阳性，阳性率58.3%（21／36）；HCMV DNA阴性孕妇（正常对照组，n＝70）ADAMTS13活性为（82.4±12.3%），显著高于宫内感染组（60.4±16.7%，P＜0.001）；HCMV mRNA阳性病例ADAMTS13活性为（51.3±15.9%），显著低于HCMV mRNA阴性病例（65.8±19.1%，P＜0.01）；正常对照组脐血vWF水平为（105.6±25.4）ng／ml，显著低于宫内感染组［（147.2±29.1）ng／ml；P＜0.05］；HCMV mRNA阳性病例脐血vWF水平为（161.3±23.3）ng／ml，显著高于HCMV mRNA阴性病例［（130.5±26.4）ng／ml；P＝0.034］；宫内感染组病例ADAMTS13活性水平与vWF抗原水平呈显著负相关（r＝－0.343，P＝0.014）。结论孕妇脐血ADAMTS13活性下降与HCMV宫内感染密切相关。

人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）属疱疹病毒科，在人群中具有较高的感染率，而孕妇是HCMV感染的高发人群。孕妇感染HCMV后，可经胎盘垂直传播，进而引起小儿中枢神经系统先天畸形以及智力发育障碍等严重后果［1］。目前认为，血管内皮细胞是HCMV的易感细胞［2］。HCMV感染血管内皮细胞后，引起微血栓等血管病理改变，下调胎盘功能，导致流产、胎儿生长受限等子代异常后果［2］。然而病毒损伤内皮细胞后启动微血栓的机制尚不明确。血管性血友病因子裂解蛋白（ADAMTS13）是一种的游离于血浆中的金属蛋白酶，属于ADAMTS超家族［3］，其生理学作用是裂解血浆中血友病因子超大多聚体（UL⁃vWF），预防微血管血栓形成［4］。有研究证实，胎盘的绒毛滋养细胞以及血管内皮细胞中，ADAMTS13均有表达［5］。但是目前ADAMTS13活性与HCMV宫内感染的相关性国内外尚无相关报道。本实验以晚孕妇女为研究对象，研究HCMV感染晚孕妇女脐血中ADAMTS13活性的变化，探讨HCMV感染与晚孕妇女脐血ADAMTS13活性的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象选择2014年10月⁃2015年10月在河南省人民医院产科住院的健康晚孕孕妇470例，年龄22⁃35岁，平均孕龄（37.6±2.3）周，无自然流产、死胎、死产等不良孕产史。本研究经河南大学人民医院伦理委员会通过，所有研究对象均签署知情同意书。所有孕妇于分娩时立即采集脐血全血和血浆均于分装后－80℃保存备用。

1.2 PCR法检测脐血HCMVDNA按照基因组DNA提取试剂盒步骤（上海赛百盛基因技术公司）抽提脐血DNA。采用PCR法检测脐血HCMV DNA水平。扩增HCMV引物如下：上游引物：5′⁃AGACGGAAGAGAAATTCACTGG⁃3′，下游引物：5′⁃GCCATAATCTCATCAGGGGAG⁃3′。PCR反应条件：94℃，3 min；94℃，30 s、55℃30 s、72℃1 min，共30个循环；72℃5 min。1.5%琼脂糖电泳，凝胶成像仪观察。另外随机选取PCR阳性产物送上海生工公司测序，最后将测序结果进行BLAST比较。RT⁃PCR法检测脐血HCMV mRNA采用Rizol法提取脐血RNA，并逆转录成cDNA。采用RT⁃PCR法检测脐血HCMV mRNA水平。HCMV扩增引物如下：上游引物：5′⁃GTGATCCGACTGGGCGAAAA3′，下游引物：5′⁃GAGCGCGTCCACAAATCTTA⁃3′反应条件：94℃，3 min；94℃，30 s、55℃30 s、72℃1 min，共30个循环；72℃5 min。1.5%琼脂糖电泳，凝胶成像仪观察。另外随机选取PCR阳性产物送上海生工公司测序，最后将测序结果进行BLAST比较。

1.3 脐血ADAMTS13活性检测采用残余胶原结合试验检测脐血中ADAMTS13的活性。实验步骤如下：（1）首先用100 μl 3μg／mL的Ⅲ型胶原稀释溶液室温下包被96孔板1 h。用250 μl的PBS液洗3次后将每孔加入200 μl 2.5%的BSA溶液，室温孵育15 min，PBS液洗3次后备用。（2）用vWF裂解酶活性assay buffer倍比（1∶320⁃2.5）稀释血浆；每份样品各取50 μl，然后加入5 μl 93 mM的BaCL2溶液，37℃孵育5 min，制备标准曲线；待检血样用vWF活性裂解酶assay buffer稀释成1∶20样品。每份样品中加入10 μl／mL的vWF溶液100 μl，37℃孵育过夜，加入10 μl Na2SO4终止反应，然后离心，取上清液40 μl，加入160 μl的ELISA稀释液于各样品中，混匀，取100 μl于96孔板内（用Ⅲ型胶原包被好），37℃孵育1 h。用250 μl的PBS液清洗96孔板三次。（3）每孔加入100 μl 1∶4000的稀释后的HRP⁃RAH⁃vWF IgG多克隆抗体（丹麦Dakocytomation公司），37℃孵育1 h。用250 μl的PBS液清洗96孔板三次。加入100 μl的邻苯二胺⁃H2O2底物溶液，室温下孵育3⁃5 min，每孔加入10 μl Na2SO4终止反应后，使用酶标仪测定492／630nm处吸光度。通过标准曲线计算样本活性值。1.4脐血vWF水平检测采用双抗夹心ELISA法检测脐血vWF抗原水平。（1）首先利用100 μl兔抗人vWF多克隆抗体（A0082，丹麦Dakocytomation公司）包被96孔高亲和力酶标板，每孔加入200 μl 3.5% BSA封闭，以1∶10⁃1∶320倍比稀释混合血样建立标准曲线。（2）将待测血样进行1∶40稀释，加入100 μl至包被好的酶标板中，37℃孵育2 h。用250 μl的PBS液清洗96孔板三次。每孔100 μl1∶5000稀释的HRP标记的兔抗人vWF多克隆抗体（P0226），37℃孵育1 h，用250 μl的PBS液清洗96孔板三次。（3）每孔加入100 μl邻苯二胺⁃双氧水显色5⁃15 min，每孔加入100 μl Na2SO4终止反应。采用酶标仪测定492／630nm处吸光度。通过标准曲线计算样本的vWF抗原水平。

1.5 统计学方法分析软件为SPSS 19.0，计量资料以±s表示，采用t检验进行两个样本间均数比较，采用方差分析法，对多个样本均数间比较，统计学差异以P＜0.05表示。

2 结果

2.1 脐血HCMV感染检测结果本研究共收集孕晚期孕妇脐血470例。脐血HCMV DNA阳性率7.65%（36／470），脐血HCMV DNA阳性36例中，21例HCMV mRNA阳性，阳性率58.3%（21／36）；从上述对象中选取孕晚期正常对照组70例（脐血HCMV DNA阴性）、宫内感染组36例（脐血HCMV DNA阳性）进行后续试验检测。

2.2 脐血HCMV感染与ADAMTS13活性正相关

正常对照组ADAMTS13活性为（82.4±12.3）%，宫内感染组ADAMTS13活性为（60.4±16.7）%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.001），结果见表1。将宫内感染组内HCMV mRNA阳性与HCMV mRNA阴性病例脐血进一步分析，结果显示HCMV mRNA阳性病例ADAMTS13活性为（51.3± 15.9）%，HCMV mRNA阴性病例ADAMTS13活性为（65.8±19.1）%；两组比较差异有统计学意义（P＜0.01），结果见表1。

2.3 脐血HCMV感染与脐血vWF水平正相关

正常对照组脐血vWF水平为（105.6±25.4）ng／ml，宫内感染组脐血vWF水平为（147.2±29.1）ng／ml，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表1。HCMV mRNA阳性病例脐血vWF水平为（161.3 ±23.3）ng／ml，HCMV mRNA阴性病例脐血vWF水平为（130.5±26.4）ng／ml，两组比较差异有统计学意义（P＝0.034），结果见表1。

表1 各组脐血中ADAMTS13活性和vWF水平比较Tab.1 Comparison of ADAMTS13 activity and vWF level in umbilical cord blood

2.4 脐血ADAMTS13活性与vWF水平负相关

宫内感染组病例ADAMTS13活性水平与vWF抗原水平呈显著负相关（r＝－0.343，P＝0.014）。而正常对照组ADAMTS13活性水平与vWF抗原水平无明显相关性（r＝－0.018，P＝0.342）。

3 讨论

HCMV是引起宫内感染最常见的病原体之一。研究发现孕妇在妊娠早期的活动性感染率约为4.2%［6］，然而早孕患者的HCMV感染率可高达36.5%［7］。HCMV宫内感染对子代的影响与妊娠阶段密切相关，例如：受精后2周内，发生HCMV宫内感染，卵裂球发育可能收到影响，从而导致流产。受精后3⁃8周，发生HCMV宫内感染，可能严重影响的胚胎的正常发育，导致自然流产、死胎、先天畸形等［8］。目前，HCMV宫内感染依然影响着我国出生质量，而且临床目前尚无有效防治手段。

目前，HCMV感染无相应的临床表现，但妊娠期妇女感染HCMV时，病毒可经血液循环感染胎盘，进行复制、包装，进而引起绒毛血管内皮病胎盘绒毛膜炎等疾病；胎盘血液循环受到阻断，引起胎儿缺氧、宫内窒息，甚至死亡。研究已经表明，血管内皮细胞是HCMV宫内感染的主要靶细胞。HCMV在血管内皮细胞内复制、扩增，诱导内皮细胞损伤，导致胎盘绒毛血管微血栓形成，胚胎血供受阻而死亡［8］。

vWF是参与血栓形成与止血的主要糖蛋白之一，能够启动血小板聚集和局部微血栓的形成。血管内皮细胞受损后vWF大量分泌并释放入血液循环，与血管内皮下暴露的胶原结合并与血小板膜上的受体GpIb／IX结合，活化血小板，促使血小板血栓形成，发挥止血的作用［9］。vWF是一种大分子多聚体糖蛋白，并以多聚体的形式存在于外周循环中，分子量范围在500 000⁃2 000 000以上。如果vWF表达过量，UL⁃vWF大量形成，导致血小板聚集，病理性微血栓生成。而ADAMTS13不仅可以降低vWF与血小板、内皮下胶原等的粘附能力，也可以裂解血浆中的UL⁃vWF，预防病理性微血栓的形成［4］。正常生理状况下，ADAMTS13可以识别并裂解vWF多聚体，释放血小板，阻碍形成血小板血栓。如果ADAMTS13活性异常，可引起vWF多聚体异常聚集，进而引起病理性微血栓。

本研究结果表明，与正常孕妇比较，HCMV宫内感染时孕妇脐血ADAMTS13活性明显降低，其原因可能与内皮细胞受病毒感染有关。何文竹等［10］研究发现HCMV感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）48 h后，HUVEC细胞裂解液及细胞上清中的ADAMTS13蛋白表达水平均显著下降，表明HCMV感染HUVEC后可以抑制细胞中ADAMTS13的表达，与本研究结论相符。此外，我们的研究结果表明，HCMV感染后脐血中vWF水平显著升高，活动性感染的孕妇其vWF水平比非活动性感染的孕妇相比较更高。提示HCMV感染促进了vWF水平的过渡表达。更重要的是，我们发现宫内感染组病例ADAMTS13活性水平与vWF抗原水平呈显著负相关，表明ADAMTS13活性异常后，难以有效裂解血浆中UL⁃vWF，导致vWF抗原水平大量增加，从而增加了病理性微血栓的发生风险。

综上所述，本研究结果表明晚孕孕妇脐血ADAMTS13活性下降与HCMV宫内感染密切相关，这可能是HCMV宫内感染诱发病理性微血栓的重要因素之一。而HCMV感染抑制ADAMTS13活性的具体分子机制还有待进一步研究。

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Correlation between cord blood ADAMTS13 activity and human cytomegalovirus infection in pregnant women

Yan Jun，Xu YAhui，Liu Kan，Wu Haiying

Department of Gynaecology and Obstetrics，Henan Provincial people’s Hospital，Zhengzhou，45000，China

ObjectiveTo explore the correlation between cord blood ADAMTS13 activity and human cytomegalovirus（HCMV）infection in pregnant women.Methods470 pregnant women in the Henan Provincial people’s Hospital between Oct.2014 and Oct.2015 were selected in this study.Cord blood was collected and HCMV DAN／RNA levels were detected by polymerase chain reaction，the activity of ADAMTS13 in cord blood was examined using Residual⁃collagen Binding Assay，the vWF levels in cord blood was examined by enzyme⁃linked immunosorbent assay.ResultsAmong 470 cases，36 were HCMV DNA positive（7.65%），and in which 21 cases were HCMV mRNA positive 58.3%（21／36）.The activity of ADAMTS13 in control group（HCMV DNA negative，n＝70）was（82.4±12.3）%，significantly higher than that of intrauterine infection group（60.4±16.7%，P＜0.01）；the levels of vWF in control group was（105.6±25.4）ng／ml，significantly lower than that of intrauterine infection group（147.2±29.1 ng／ml，P＜0.05）；The activity of ADAMTS13 was negatively correlated with vWF levels in pregnant women with intrauterine HCMV infection（r＝－0.343，P＝0.014）.Conclusions HCMV intrauterine infection was significantly associated with decreased activity of ADAMTS13 in cord blood in in the late pregnancy.

Human cytomegalovirus；ADAMTS13；Pregnant women；vWF

武海英，E⁃mail：ezsr1201＠163.com

10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2016.06.000

人巨细胞病毒；ADAMTS13；孕妇；vWF抗原

2016⁃07⁃06）