WNK1激酶对Maxi K通道的调节作用

施珍，周丽娜，张益前，王德选，庄捷秋

（1.温州医科大学附属第二医院 肾内科，浙江 温州 325027；2.温州市人民医院 肾内科，浙江 温州325000；3.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童肾内科，浙江 温州 325027）

・论 著・

WNK1激酶对Maxi K通道的调节作用

施珍1，周丽娜2，张益前1，王德选3，庄捷秋3

（1.温州医科大学附属第二医院 肾内科，浙江 温州 325027；2.温州市人民医院 肾内科，浙江 温州325000；3.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童肾内科，浙江 温州 325027）

目的：研究WNK1激酶对Maxi K通道的调节作用。方法：将携带WNK1和Maxi K目的基因的质粒DNA转染在HEK-293T细胞上，分别应用细胞免疫荧光染色、Western blot观察WNK1对Maxi K在细胞上分布及总蛋白表达水平的影响。结果：免疫荧光染色发现实验组的Maxi K在细胞上的分布明显增多。Western blot结果显示，与对照组相比，实验组1和实验组2的Maxi K总蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01）；与实验组1相比，实验组2的Maxi K总蛋白表达水平亦明显升高（P＜0.05）。结论：WNK1能上调Maxi K的总蛋白表达水平，且随着WNK1 DNA剂量的增加，上调作用逐渐增强，显示其上调作用具有剂量依赖性。

WNK1；Maxi K；假性醛固酮减少症Ⅱ型；高血压

高血压是冠心病、脑卒中等众多心血管疾病最大的独立危险因素。高血压的发病机制非常复杂，包括遗传和非遗传因素。其中一些离子通道和转运体在高血压发病机制中的作用逐渐引起科研工作者的关注。WNK激酶（with no lysine kinase）是一类新发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因其家族成员在激酶功能领域缺乏与ATP结合的赖氨酸而得名[1]。迄今，在人类共发现了该家族的4个成员，即WNK1、WNK2、WNK3和WNK4。其中WNK1有2种类型，全长WNK1（full-length WNK1，L-WNK1）和肾脏特异性WNK1（kidney specific WNK1，KS-WNK1）。许多研究提示，WNK激酶构成了一种新的信号通路，是目前高血压研究的一个热点。Maxi K通道，又称为钙激活钾通道，广泛分布于心肌以外的各种不同组织中如肾脏、神经系统，在平滑肌上分布尤为丰富[2]，与高血压有着不容忽视的联系。本研究聚焦于与高血压关系密切的2个新兴分子，WNK1激酶和Maxi K通道，在人胚肾细胞（HEK-293T细胞）上研究WNK1激酶对Maxi K的调节作用，旨在探索高血压的发病机制，为新的降压药的研发提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料 HEK-293T细胞株购于上海中科院；WNK1、Maxi K和Vector的质粒DNA均由美国Emory大学医学院肾脏科蔡晖教授实验室提供；单克隆小鼠抗HA抗体、单克隆小鼠抗myc抗体、单克隆小鼠抗β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司；FITC标记的山羊抗小鼠IgG、FITC标记的山羊抗兔IgG购于上海钰森公司；TRITC标记的山羊抗小鼠IgG购于北京中杉公司；实验设备和实验场所由温州医科大学附属第二医院科研中心提供。

1.2 方法

1.2.1 HEK-293T细胞的培养和转染：HEK-293T细胞常规培养于含10% FBS+1%青/链霉素的DMEM培养液的培养皿（规格为10 cm）中，置于细胞培养孵育箱（37 ℃，5% CO2，饱和湿度）内孵育。细胞分离24～36 h观察到细胞贴壁生长丰度达到70%～80%时，为转染质粒DNA的最佳时机。将所需的质粒DNA+脂质体2000+OPTI-MEM（不含血清）混合物均匀滴入培养皿中，轻摇混匀，放入细胞培养孵育箱内，5 h后弃去OPTI-MEM（不含血清），加入10 mL细胞培养液，重新放置细胞孵育箱里孵育；细胞转染质粒DNA后36～48 h，即可进行下一步实验。

1.2.2 免疫荧光法观察WNK1激酶对Maxi K在细胞上分布的影响：在1.5 mL的尖底带盖离心管中加入0.3 mL OPTI-MEM和3 μL的脂质体2000，混匀；然后在对照组中转染pCDNA 4.0 Vector（空白质粒）3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg，实验组中转染pCDNA 4.0 his-myc WNK1 3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；振荡混匀后在室温下放置30 min。再将质粒DNA+脂质体2000+OPTI-MEM混合物均匀滴入培养有HEK-293T细胞的培养皿中，轻摇混匀，放入细胞培养孵育箱（37 ℃，5% CO2，饱和湿度）内，5 h后弃去OPTI-MEM，加入2 mL DMEM细胞培养液，重新放置细胞孵育箱里孵育。细胞转染后48 h后，进行免疫荧光染色和荧光显微镜观察。实验中使用单克隆小鼠抗HA抗体和FITC标记山羊抗兔IgG检测Maxi K，荧光颜色呈现为绿色。细胞转染所需质粒DNA见表1。

1.2.3 Western blot法观察WNK1激酶对Maxi K总蛋白表达水平的影响：在HEK-293T细胞上，对照组转染pCDNA 4.0 Vector 6 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；实验组1转染pCDNA 4.0 his-myc L-WNK1 3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；实验组2转染pCDNA 4.0 his-myc L-WNK1 6 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg。转染2 d后，提取蛋白，进行Western blot检测。实验中使用的一抗：单克隆小鼠抗myc抗体（1∶500），单克隆小鼠抗β-Actin抗体（1∶500），单克隆兔抗HA抗体（1∶1 000）；二抗：HRP山羊抗小鼠IgG抗体（1∶5 000），HRP山羊抗兔IgG抗体（1∶5 000）。使用Supersignal显色进行显影和定影来检测WNK1、Maxi K和β-actin。细胞转染所需质粒DNA见表2。

表1 免疫荧光法中细胞转染所需质粒DNA（n=3）

表2 Western blot法中细胞转染所需质粒DNA（n=3）

1.3 统计学处理方法 采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。所有数据均采用±s表示，进行正态性检验，多组样本均数比较进行方差齐性检验，方差齐性组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，方差不齐则采用Dunnett T3检验。非正态数据组间采用Krukal-Wallis H检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HEK-293T细胞的形态 HEK-293T细胞株来源于人胚肾上皮细胞，用于本实验的外源基因的转染。倒置显微镜下观察HEK-293T细胞贴壁生长，呈三角形或多角形，胞浆透亮，胞核可见，有的胞膜向周围突起成不规则形，提示细胞生长状态良好，见图1。

2.2 免疫荧光结果 对照组转染pCDNA 4.0 vector（空白质粒）3 μg和pCMV-HA Maxi K 1 μg；实验组转染pCDNA 4.0 his-myc L-WNK1 3 μg和pCMVHA Maxi K 1 μg。绿色荧光为Maxi K在细胞上的表达。在对照组中，Maxi K表达量不多，主要位于细胞膜表面，而在实验组中，Maxi K表达明显增多，分布于细胞膜和细胞浆内，见图2。

图2 HEK-293T细胞免疫荧光结果（×400）

2.3 Western blot结果 与对照组相比，实验组1和实验组2 Maxi K总蛋白表达水平均明显升高（P ＜0.01）。而与实验组1相比，实验组2 Maxi K总蛋白表达水平亦明显升高（P＜0.05）。由此可见，WNK1激酶对Maxi K总蛋白表达存在上调作用，且这种上调作用呈剂量依赖性，见图3。

图3 WNK1激酶对Maxi K总蛋白表达水平的影响

3 讨论

假性醛固酮减少症I I型（pseudohypoaldosteronism I I，PHA I I），又称为Gordon综合征，临床上表现为高血压、高钾血症、高氯血症、代谢性酸中毒和正常的肾小球滤过率。Wilson等[3]发现位于12号染色体上的WNK1基因缺失和位于17号染色体上的WNK4基因错义突变可导致PHA I I的发生。此后，Hoorn等[4]进一步发现WNK1基因的缺失和WNK4基因的突变导致下游钠氯共转运子（sodium chloride cotransporter，NCC）等重吸收钠氯离子增加所致，拮抗剂噻嗪类利尿药可有效控制PHA I I患者的高血压症状。目前研究提示，WNK激酶构成了一种新的信号通路，它们是肾脏中多个离子转运体和通道的上游调控蛋白，在维持肾脏血压调控及电解质平衡中起非常重要的作用[5-6]。WNK1是WNK家族中第一个被发现的成员，是科研学者在从大鼠脑cDNA文库中筛选MEK激酶家族新成员时发现。人WNK1基因位于12p13.3，基因全长为150 kb，主要有2个转录本，一个为L-WNK1，约12 kb，主要表达在骨骼肌和心脏组织；另一个为短转录本，约10 kb，主要表达在肾脏，该转录本的产物无蛋白激酶活性，被称KSWNK1。本研究中的WNK1为L-WNK1。Kahle等[7]研究显示，WNK1几个常见的单核苷酸多态性和单倍型与普通人群动态血压的变化相关。Newhouse等[8]研究发现，一个靠近WNK1启动子的单核苷酸多态性位点与高血压的严重程度具有相关性，并且提示WNK1表达增加可能提高原发性高血压的变异性和易感性。

新的研究发现钙激活钾通道，又可称为Maxi K、BK通道或Slo1，为电压门控钾离子通道超家族中的一员，电导大（100～300 pS），由Slo1基因编码。近年来，人们通过研究发现，许多疾病的发生均与Maxi K通道的调节异常有关。生理条件下，Maxi K通道持续激活并作为超极化因素以减少电压依赖的钙离子内流，在维持血管平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）静息膜电位上起着重要作用。Maxi K被阻断即可引起平滑肌收缩，进而导致高血压的产生。在大鼠主动脉及基底动脉SMC和人动脉SMC中，当Maxi K被其特异性抑制剂IbTx阻滞后，它们将产生血管收缩及对抗血管扩张剂的扩血管作用[9]。

目前的研究报道WNK1激酶对血压及电解质平衡的调控得益于它对多种离子通道和离子转运体如ROMK、ENaC、NCC及NKCC的调控。至于WNK1对与高血压密切相关的Maxi K通道是否有调节作用，目前在国内外报道很少。本研究团队已报道WNK4激酶能抑制Maxi K通道的的表达及分布[10]。所以我们设想，是否WNK1激酶对Maxi K通道亦存在调节作用。基于以上理论及研究思路，本研究在HEK-293T细胞中转染携带WNK1和Maxi K基因的质粒进行研究。通过免疫荧光染色发现WNK1能显著增加Maxi K在细胞上的分布。而Western blot进一步证实，WNK1能上调Maxi K的总蛋白表达水平，且随着WNK1 DNA剂量的增加，上调作用逐渐增强，显示其上调作用具有剂量依赖性。这些结果显示WNK1激酶和Maxi K通道之间存在一种新的信号途径。这也解释了PHA I患者表现高血压的可能机制，由于患者WNK1基因的缺失导致Maxi K通道表达的减少，不能维持血管SMC的静息膜电位，从而导致高血压的产生。和其它膜转运体或通道的功能可通过其转运途径的几个可能机制被调节一样，Maxi K通道表达的升高是由于其蛋白合成增加、或减少了蛋白的迁移、降解所致，目前尚不清楚。这也是我们下一步实验的目标，进一步阐明其可能存在的机制。

我们相信，WNK1激酶对Maxi K通道的调节将是一个新的发现，将对阐明高血压的发病机制及开发新的降压药作用靶点具有重要的意义，有助于设计新的高血压治疗方案，为高血压患者提供更多更有效的治疗药物。

[1]XU B, ENGLISH J M, WILSBACHER J L, et a1.WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II[J].J Biol Chem, 2000, 275(22): 16795-16801.

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[10]庄捷秋, 王德选, 张益前, 等.WNK4激酶通过溶酶体途径抑制BK通道表达[J].中华肾脏病杂志, 2012, 28(4): 291-295.

（本文编辑：吴昔昔）

Investigation of the adjusting effect of WNK1 kinase on Maxi K channel

SHI Zhen1, ZHOU Lina2, ZHANG Yiqian1, WANG Dexuan3, ZHUANG Jieqiu3.
1.Department of Nephrology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Nephrology, Wenzhou People’s Hospital, Wenzhou, 325000; 3.Department of Pediatric Nephrology, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To investigate the adjusting effect of WNK1 kinase on Maxi K channel in HEK-293T cells.Methods: The DNA plasmid carrying WNK1 and Maxi K gene was transfected into the HEK-293T cells, to observe the distribution and total protein expression of Maxi K in the HEK-293T cells via immunofl uorescence microscopy and Western blot.Results: Immunofl uorescence microscopic study showed that Maxi K expression was markedly increased in experimental group compared with the control group.Western blotting analysis showed that total Maxi K protein level was markedly increased in the presence of experimental group 1 and experimental group 2 compared with the control group (P＜0.01).The total Maxi K protein level was markedly increased in experimental group 2 compared with the experimental group 1 (P＜0.05).Conclusion: WNK1 can upregulate total protein expression of Maxi K, and the effect is enhanced with the increasing amount of WNK1 DNA, showing that the effect was dose-dependent.

WNK1; Maxi K; pseudohypoaldosteronism II; hypertension

R544.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.003

2016-03-04

国家自然科学基金资助项目（81170709）；温州市公益性科技计划项目（Y20150184）。

施珍（1982-），女，浙江丽水人，主治医师，硕士。

庄捷秋，主任医师，Email：jieqiuzhuang@hotmail.com。