马传染性贫血的实验室检测方法

2016-02-03齐海霞张海云曹院章唐艳荣张雪梅

中国畜牧兽医文摘 2016年4期

关键词：平皿琼脂传染性

齐海霞张海云曹院章唐艳荣张雪梅郭睿

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京 100018）

马传染性贫血的实验室检测方法

齐海霞张海云曹院章唐艳荣张雪梅郭睿

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京 100018）

马传染性贫血病简称马传贫，是由反转录病毒科慢病毒亚科中的马传染性贫血病病毒感染引起，常发生于马、骡、驴。其特征主要为间歇性发烧、消瘦、进行性衰弱、贫血、出血和浮肿；在无烧期间，症状逐渐减轻或暂时消失。患病后，病畜丧失劳动力，且成为新的传染源，重者导致死亡，对养马业造成严重危害，是各动物疫病防控单位每年春秋两次检疫工作中的重中之重。

马传贫目前常用的检测方法为补体结合反应、琼脂扩散反应、斑点试验3种，其中，又以琼脂扩散反应试验最为经济实用和准确，是目前实验室应用最多的方法，笔者结合多年积累的检测经验介绍检测细节及注意事项，供实验室技术人员参考。

方法遵循《马传染性贫血病琼脂凝胶免疫扩散试验方法》（NY/T 569-2002）。

1　原理

抗原与抗体的结合能在琼脂孔中产生沉淀线。

2　仪器设备

普通天平、吸管、三角瓶、90mm的平皿、冰箱、水浴箱、250ml量筒、打孔器、酒精灯、纱布、小刀、棉花、仪器、玻璃笔、带盖磁盘、恒温箱、滴管。

3　试剂

优质琼脂粉，蒸馏水，抗原，阳性血清，PBS液，

PBS液的配制：

pH7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）。磷酸氢二钠（12H2O）2.9g；磷酸二氢钾0.3g；氯化钠8.0g；无离子水式蒸馏水1000ml。

4　琼脂板制备

琼脂板规定为90mm平皿，外周孔径为6mm、中央孔径为4mm、空间距为3mm的打孔器，带盖瓷盘。将直径90mm的平皿放在水平台上，每平皿倒入热琼脂液15～18ml，厚度2.5mm左右。此环节很重要，操作者要在平日工作中多加练习，一定要均匀倒入，手要稳、准，不要产生气泡，否则会影响沉淀线的完整出现，影响结果判定。冷凝后加盖，把平皿倒置，防止水分蒸发，放在普通冰箱中4℃可保存2周左右。

5　打孔

反应孔现用现打，这一点比较重要，不能因为检测的血样数量多就提前批量打孔，否则影响封孔的效果，也会影响到结果判定。用外周孔径为6mm、中央孔径为4mm、孔间距为3mm的七孔打孔器在琼脂板上打孔，打孔后用8＃针头将孔内琼脂排出，用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚熔化为止，封闭孔的底部。这一步需要熟练操作的经验，酒精灯的火候与温度纯属个人经验的积累，温度低了封不住，加检测试剂时会发生侧漏，温度过高时会烤化琼脂，也会侧漏，影响结果判定。

6　加样检测

在准备好的琼脂板上端写上日期及编号。在中间孔加抗原，2、5孔加检测用标准阳性血清，其余1、3、4、6孔分别加入受检马血清，G为加抗原孔，（+）为加检测用标准阳性血清孔，加至孔满为止，这一步需注意，加样量要准确，一般为30微升，但也要根据加样孔的深浅调整样品量，以孔刚好满而不溢出为准，平皿加盖，待孔中液体吸干后，将平皿倒置，以防水分蒸发；琼脂板则放入铺有数层纱布的带盖搪瓷盘中。置15℃～30℃条件下进行反应，逐日观察3d并记录结果，这一步需注意，一定要每日观察并记录清楚结果，为最后的判定做好准备。

7　结果判定

为了判定观察方便，在与平皿有适当距离的下方，置一黑色纸或白纸衬托，有助于结果准确判定。在观察结果时，最好从不同折光角度仔细观察平皿上抗原与受检血清孔之间有无沉淀线。

7.1阳性

当检测用标准阳性血清孔与抗原之间有一条明显致密的沉淀线时，受检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线；或者阳性血清的沉淀线末端在毗邻的被检血清孔处向抗原孔侧偏弯者，此种受检血清判为阳性。对于阳性的血样一定要再去采集一次血样进行检测，如果第二次也是阳性才能最终判为阳性。如果第2次为阴性，必须重复采集第3次，3次中以2次相同的结果为最终结果。

7.2阴性

受检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性血清孔与抗原之间的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或向受检血清孔侧偏弯者，此种受检血清为阴性。

7.3疑似

标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端，似乎向毗邻受检血清孔内侧偏弯，但不易判断时，可将抗原稀释2倍、4倍、6倍、8倍进行复试。最后判定结果观察时间可延至5d。这一点很重要，只要出现疑似结果的必须按上述方法进行重复操作，直至能准确判定为止，避免出现判定不准确或者误判的情况。

7.4注意事项

判定时要注意非特异性沉淀线。例如当受检马匹近期注射过组织培养疫苗的乙型脑炎等，可见与检查用标准阳性血清的沉淀末端不是融合而为交叉状，两个血清间产生的自身免疫沉淀线等。一定要充分掌握受检马匹的详细免疫状况与健康状况后再进行判定。