祛风清热通络法对三叉神经痛大鼠三叉神经节痛觉信号传导途径的影响

吴远华 司凯隆

(贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550002)



祛风清热通络法对三叉神经痛大鼠三叉神经节痛觉信号传导途径的影响

吴远华 司凯隆1

(贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550002)

目的 探讨三叉神经痛大鼠模型三叉神经节痛觉信号传递机制及以祛风清热通络法为核心治疗本病的作用途径。方法 采用祛风清热通络法，运用慢性缩窄环法制作三叉神经痛大鼠模型，造模成功后进行动物模型三叉神经节离体培养，采用实时定量PCR法检测三叉神经节降钙素基因相关肱(CGRP)mRNA，探讨该法对动物模型三叉神经痛觉信号传递机制的干预作用。结果 各组三叉神经节CGRP mRNA表达量依次为空白组<高剂量组<卡马西平组<中剂量组<阴性对照组<低剂量组，高、中剂量组与阴性对照组相比CGRP mRNA表达下调明显(P<0.05)；高剂量苗药对三叉神经节CGRP mRNA表达的抑制作用较卡马西平强，但差异不显著(P>0.05)。结论 高剂量苗药能下调CGRP mRNA表达，可能是通过影响CGRP的合成和释放使CGRP含量减少，从而使三叉神经节痛觉信号传导途径受阻而起到缓解疼痛的作用。

三叉神经痛；三叉神经节；痛觉信号传递；祛风清热通络法

苗药血飞荜茇定痛汤方药制剂由见血飞(飞龙掌血)、荜茇、苕叶细辛、白芷、全蝎、蜈蚣、大血藤、川芎、赤芍、白芍、炙甘草组成，具有祛风清热通络之功效，常用来祛瘀止痛等。原发性三叉神经痛以气血失调，肝胃郁热，酿生风火，气血逆乱为发病的主要机制。本研究拟以祛风清热通络法为核心治法对三叉神经痛模型大鼠展开实验研究，探讨该法对模型动物三叉神经节痛觉信号传递的影响，为治疗三叉神经痛提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验药物、试剂及仪器 苗药血飞荜茇定痛汤方药制剂由贵阳中医学院第一附属医院中药制剂室提供。苗药配方：见血飞(飞龙掌血)、荜茇、苕叶细辛、白芷、全蝎，蜈蚣、大血藤、川芎、赤芍、白芍、炙甘草。紫外分光光度计；PCR扩增仪；CGRP基因引物和探针；RNA提取及逆转录试剂；DNA扩增试剂及标准品等。

1.2 实验动物的选择、分组及给药方法 选择健康成年雄性SD大鼠多只，平均体重(250±20)g。术前测定疼痛阈值(作为基础痛阈)后，行左侧眶下神经-慢性缩窄损伤环扎术。在手术第14天开始观察是否出现痛觉超敏症状，出现了痛觉超敏症状者将作为入选对象。入选后的大鼠根据完全随机分组原则进行分组：正常空白组：自然环境、普通饲料饲养，以生理盐水灌胃，每日1次，灌胃14 d。阴性对照组：测定术前疼痛阈值(作为基础痛阈)后，进行左侧眶下神经(ION-CC)环扎术制作三叉神经痛大鼠模型，通过对环扎线标记比较其松紧度及手术线的选择等优化选择造模方法的指标，选出最优造模方案。造模成功后以生理盐水灌胃，每日1次，灌胃14 d。治疗组：造模成功后给予血飞荜茇定痛汤灌胃，高、中、低剂量分别按成人临床用药剂量的20倍、10倍、5倍计算，每日1次，灌胃14 d。阳性对照组：造模成功后给予卡马西平治疗，相当于成人剂量的10倍，每日1次，灌胃14 d。

1.3 大鼠三叉神经节离体培养模型的建立 三叉神经痛大鼠模型造模成功14 d后，麻醉后用750 ml/L酒精浸泡3 min，然后进行消毒，再行断头处死，用止血钳沿枕骨大孔端层层剥开颅骨和颞骨并刮掉大脑、小脑，充分暴露三叉神经，轻轻剪断三个感觉根取出神经节，将神经节取出并放在冷的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，慢慢将周围的脂肪、血管、神经鞘膜等结缔组织从神经节中剔除，变成乳白色，保存在4℃PBS中备用。24孔培养板内每孔盛2 ml DMEM(Sigma，USA)培养液(加青霉素100 U/ml，链霉素100 mg/L以及两性霉素B 25 mg/L)。放置在37℃恒温培养箱中培养，持续给予含50 ml/L CO2O2，把pH值维持在7.4，每24 h更换1次培养液。

1.4 实时定量PCR检测降钙素基因相关肽(CGRP)mRNA表达量 用FastPrepA试剂盒(QBIOgene，CA，USA)中1 ml RNA proTM液(Q-BIOgene，CA，USA)匀浆进行处理组织，按程序提取总RNA。采用1%普通琼脂糖凝胶电泳检测总RNA。cDNA的逆转录采用Gene Amp RT试剂盒(PE Applied Biosystems)。Real-time PCR使用GeneAmp SYBR Green PCR试剂盒(PE Applied Biosystems)，Perkin-Elmer PCR仪(PE，GeneAmp 5700)。管家基因GAPDH：上游引物：5′-GGCCTTCCGTGTCCTACC-3′，下游引物：5′-AGGTGTTGGTGCTGGACACA-3′，引物长度55 bp。CGRP(M34090)：上游引物：5′-GAGGCAGCTACAAGGTTCAGG-3′，下游引物：5′-CGGCATGTCAGATCCACAAC-3′，引物长度151 bp。PCR反应体系为50 μl，先50℃ 2 min，95℃ 10 min，再95℃ 15 s和60℃ 1 min，共循环40次，待反应结束，采用分离曲线进行分析，确定反应产物的特异性。定量数据分析采用PCR循环阈值(Cycle threshold，Ct)，用GAPDH的Ct值作为内对照，计算CGRP mRNA的相对表达量。标准曲线根据Ct=1 g〔浓度/(1+E)〕方程绘制，代表扩增效率，根据标准曲线的斜率计算，理想斜率=3.3，理想扩增效率=100%。标准曲线验证CGRP和GAPDH的cDNA在PCR反应体系里扩增效率相同。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0软件行单因素方差分析及SNK-q检验。

2 结 果

2.1 总RNA浓度 用紫外分光光度计测定各组样本RNA的260 nm、280 nm波长OD值，OD260/OD280比值为1.8～2.0，提示RNA纯度较好，无明显污染。

2.2 三叉神经节中CGRP mRNA表达水平 高剂量组三叉神经节CGRP mRNA表达量(0.294 8±0.003 2)最低，其余造模组均高于高剂量组，依次为：阳性对照组(0.295 5±0.000 4)<中剂量组(0.316 5±0.003 0)<阴性对照组(0.331 8±0.004 0)<低剂量组(0.344 7±0.003 5)<空白组(0.353 2±0.004 5)；高、中剂量组与阴性对照组相比，CGRP mRNA表达下调明显(P<0.05)；高剂量苗药对三叉神经节CGRP mRNA表达的抑制作用较卡马西平强，但差异不显著(P>0.05)。

3 讨 论

原发性三叉神经痛的原因尚未明确，临床表现为三叉神经分布区短暂而反复发作的剧烈性疼痛。三叉神经痛属祖国医学中“面痛”、“头风”等范畴〔1〕。《张氏医通》云，面痛皆因于火，而虚实之殊。张运凯等〔2〕提出：三叉神经痛总厥阴少阳，阳明，肝胆风火，肠胃燥热，闭阻经络，脉满肿胀，迫及神经而剧痛突然发作。我国对三叉神经痛的研究大多数为临床分析，有研究指出运用苗药治疗原发性三叉神经痛取得好的疗效〔3〕，但对其发病机制，特别是苗药的作用机制方面研究较少。

CGRP作为一种生物活性多肽，主要存在于三叉神经节和背根神经节等部位〔4〕，具有强烈的扩血管作用，能增加毛细血管通透性血浆蛋白的渗出。CGRP主要是通过cAMP-PKA-MEK-ERK-CREB信号转导途径参与疼痛过程。本研究发现，相对于阴性对照组而言，高剂量组对三叉神经节CGRP mRNA表达的抑制作用较强。原因可能是苗药中的成分如大血藤、见血飞、苕叶细辛等达到一定浓度后，可通过多种途径干扰CGRP合成，使得CGRP发出抑制信号，降低CGRP的合成量，阻滞了cAMP-PKA-MEK-ERK-CREB信号的传导。同时，有文献指出，在感觉神经节中CGRP与背角P物质(SP)共存，SP作为一种传递伤害性刺激信息的神经递质，能增加伤害性信息的传导〔5，6〕。在痛觉传导过程中，CGRP能增加SP的释放，增强了痛觉信号的传导〔7〕；加上CGRP抑制SP的降解酶，延长了SP的作用时间，进一步加强了痛觉信号的传递〔8〕。而苗药中各成分可能降低CGPR的表达，减少SP的释放，在一定程度上激活SP降解酶，使SP在量上和活性上都可能降低，阻滞了痛觉信号传导通路的传递。还有一种可能的原因是苗药中各种成分的浓度较高，与CGRP竞争结合位点的可能性增加，减少CGRP与相应位点的结合，CGRP不能结合而被降解。

卡马西平是治疗三叉神经痛的一线药，卡马西平会给患者带来头昏、嗜睡、共济失调、皮炎等副作用〔9〕。一定剂量的苗药可以降低CGRP mRNA的表达量，缓解三叉神经痛。提示在治疗三叉神经痛时可以考虑一定剂量的苗药和一定剂量的卡马西平联合使用，既能减少卡马西平的使用量、降低卡马西平的副作用，又能增加疗效、缓解疼痛。

1 张美增，郭瑞友，王 岭.中西医结合神经病学〔M〕.北京：科学技术文献出版社，2014：212-3.

2 张运凯，赵锡武.偏头痛方治疗三叉神经痛5例〔J〕.湖北民族学院报，2004；21(2)：35-6.

3 吴远华，邵 勇，朱广旗，等.血飞荜茇定痛汤治疗原发性三叉神经痛34例〔J〕.陕西中医，2010；31(8)：1006-7.

4 郑林丰，谢应桂，许愿忠.降钙素基因相关肽在神经系统损伤中的作用〔J〕.创伤外科杂志，2006；8(6)：571-3.

5 Hutchins B，Spears R，Hinton RJ，etal.Calcitonin gene-related peptide and substance P immunoreactivity in rat tri-geminal ganglia and brainstem following adjuvant-induced inflammation of the temporomandibular joint〔J〕.Arch Oral Biol，2000；45(4)：335-45.

6 黄 飞，张 敏，张 曼，等.心理应激对大鼠三叉神经节降钙素基因相关肽表达的影响〔J〕.口腔医学研究，2008；24(6)：619-21.

7 Ghatta S，Nimmagadda D.Caleitonin gene-related peptide：understanding its role〔J〕.Indian J Pharmacol，2004；36(5)：277-83.

8 朱遵燕，杨晓秋.三叉神经慢性缩窄环术大鼠血降钙素基因相关肽及P物质变化〔J〕.解放军医学杂志，2011；36(4)：376-8.

9 何俐钧，余建萍.奥卡西平与卡马西平治疗原发性三叉神经痛的疗效及副作用比较〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(21)：4786-7.

〔2015-11-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

贵州省科学技术基金项目(黔科合J字〔2011〕2303号)

司凯隆(1989-),男，住院医师，主要从事中西医结合治疗神经性疼痛的研究。

吴远华(1976-)，男，硕士，副主任医师，主要从事中西医结合治疗脑血管病研究。

R745.11

A

1005-9202(2016)22-5517-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.010

1 贵阳中医学院