圈养滇金丝猴粪便可培养菌群的分离鉴定及药敏试验

黄小兰，李素华，尹红斌，许　洁，武　悦

（1.西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224；2.云南省动物卫生监督所，云南 昆明 650051；3.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌 402460）

圈养滇金丝猴粪便可培养菌群的分离鉴定及药敏试验

黄小兰1，李素华1，尹红斌2，许洁3，武悦1

（1.西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224；2.云南省动物卫生监督所，云南 昆明 650051；3.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌 402460）

本试验采用选择性培养基分离了滇金丝猴新鲜粪便5种优势菌，生化反应法进行菌落鉴定，K-B药敏纸片法测定细菌药物敏感性。结果显示，从滇金丝猴粪便中分离鉴定出了7种好氧细菌：埃希大肠杆菌（Escherichia coli）、志贺菌（Shigella）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、伪产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、摩氏摩根菌（Mor⁃ganella morganii）、屎肠球菌（Entercoccus faecium）、肠球菌PNS-E3（Entercoccus PNS-E3）；3种厌氧菌：粪便拟杆菌（B ster⁃coris）、乳杆菌（Lactobacillus brevis）、双歧杆菌（Bifidobacterium）。药敏试验结果表明，10种肠道菌对红霉素、青霉素G、头孢唑啉、呋喃妥因、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶（复合）、克林霉素、氯霉素、头孢他啶、环丙沙星呈现出不同程度的药物敏感性。

滇金丝猴；粪便菌群；分离鉴定；药敏性

滇金丝猴（Rhinopithecus bieti）又名黑白仰鼻猴、黑金丝猴、云南仰鼻猴，隶属于哺乳纲（Mam⁃malia），灵长目（Primates），猴科（Cercopithecidae），疣猴亚科（Colobinae），仰鼻猴属（Rhinopithecus）。滇金丝猴是我国国家Ⅰ级重点保护物种，现存种群数量约为1 000～1 500只[1]。虽然众多学者与专家从滇金丝猴的生活习性、栖息地等生态学方面做了大量的研究，为制定其保护举措提供了理论基础，但是滇金丝猴种群数量依旧不容乐观。患病死亡是滇金丝猴种群濒危一个不可忽视的因素，在所有野生动物疾病中，消化系统疾病（如消化不良、腹泻等）最为常见[2]。动物机体肠道内定植着大量的细菌细胞，数量多达1 014个，种类超过500种[3]。一般来说肠道菌群分析最少要分析类杆菌（拟杆菌）、双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌和肠球菌等这5类菌，大致就包括了下消化道的优势菌群[4]。动物的下消化道菌群即结肠菌群基本上与粪便菌群无异。因此，采集粪便标本可以进行肠道菌群分析，尤其是了解下消化道菌群的变化。本研究采用选择性培养基分离滇金丝猴新鲜粪便5种优势菌，生化法进行菌落鉴定，并将分离到的细菌进行药敏试验以探讨其致病性并筛选临床治疗高敏药物，以期完善滇金丝猴保护措施。

1　研究方法

1.1主要试剂营养肉汤（nutrient broth，NB）、脑心浸出液（brain heart infusion，BHI）、肠杆菌选择性培养基（luria-bertani，LB）、肠球菌选择性培养基胆汁七叶苷叠氮钠琼脂（bile esculin azide agar，BEA）、双歧杆菌培养基（bifidobacterium selective agar，BLS）、拟杆菌培养基（bacteroid selective agar，BDS）、乳杆菌培养基（lactobacillus selective agar，MRS），购自青岛日水生物技术有限公司；三糖铁琼脂（triple sugar iron agar，TSI）、水解酪蛋白琼脂（muller-hinton agar，MH）、细菌生化鉴定管及配套指示剂，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2样品采集及增菌培养本研究中的粪便样品均来自昆明圆通山动物园圈养的1只成年雄性滇金丝猴。取样时间从2011年11月至2013年2月，每月至少取样1次，共收集到可进行菌群分离培养的粪便样品16次。取样前确定滇金丝猴机体处于健康水平，无排便异常，且1周内无抗生素使用史。用无菌镊子将自然排出的新鲜粪便3份，放入无菌干燥采样袋内，置于冰盒中，30 min内送回实验室。同样的方法取粪便周围土壤样品。超净工作台内剔除粪便样品表层，并称取1 g接种于50 mL NB中置于37℃恒温培养箱进行好氧培养24 h。同法处理土样。另取0.5 g接种于15 mL BHI培养基中，用液体石蜡封口，置于37℃恒温培养箱进行厌氧培养48 h。

1.3菌落的计数及检出率统计将NB培养液倍比稀释至10-9，吸取10-5～10-95个稀释度菌液20 μL接种于LB和BEA上，37℃培养24 h后观察菌落的生长情况。BHI培养液倍比稀释至10-6，方法同上，接种于MRS、BDS、BLS平板，37℃厌氧培养48～72 h后观察菌落的生长情况。进行平板计数，根据稀释度计算菌落数量，用每克粪便样品所含的各种微生物数目的常用对数表示，即lgN/g。计算16次菌落数量的均值，以Mean±SEM表示。将各菌种在16次培养中出现的次数除以采样次数得到其检出率。

1.4细菌的分离纯化挑取纯菌落，接种于各选择性培养基中，采取划线法进行分离纯化。来源于土壤样品的菌落亦接种于LB培养基进行分离纯化。

1.5生化鉴定参考《伯杰细菌鉴定手册》[5]，肠杆科细菌生化鉴定根据杭州天和肠杆菌科细菌生化鉴定编码册第二代15e系统进行鉴定；肠球菌生化鉴定采用杭州天和试剂有限公司肠球菌科细菌生化鉴定套管。针对不同的菌株选择相应的生化试验项目进行试验，将细菌鉴定到属、种。

1.6药敏试验按照CLSL（Clinical and Laborato⁃ry Standards Institute）推著的K-B纸片扩散法进行，测量各种药物的抑菌圈直径，以判定药物对细菌的抑制作用。判定标准参照美国实验标准委员会（NCCLS）药敏纸片扩散法规标准。

2　结果

2.1细菌计数5种选择性培养基上的细菌菌落数量及检出率见表1。统计结果显示，肠杆菌、肠球菌为滇金丝猴肠道的优势菌群，检出率为100%，其次为乳杆菌，检出率为87.5%，拟杆菌、双歧杆菌的检出率最低，分别为12.5%、25%。

2.2生化鉴定结果菌液在选择性培养基培养24～48 h后，挑取单菌落，通过3代划线分离培养，得到不同形态特征的纯菌株共27个。从粪便样品分离到的纯菌落分别为19株，土壤样品分离到8株，其中19株肠杆菌科菌落、3株肠球菌科菌落、5个厌氧菌株。

19株肠杆菌科细菌中发酵革兰阴性菌有14株，其中有3株均被确定为志贺菌属（Shigella）；11株确定到种，2株为摩氏摩根菌（Morganella morganii）、6株为大肠埃希菌（Escherichia coli）、1株为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、2株为黏质沙雷杆菌（Serratia marcescens）。非发酵革兰阴性杆菌5株均确定到种，2株为伪产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、2株为恶臭假单胞菌（P.putica）、1株为溶血巴斯德菌（Pasteurella trevisan）。根据菌落形态、革兰染色特征及菌体形态及初步鉴定，将试验所得菌落归为拟杆菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属3类厌氧菌。3株肠球菌科菌落进行生化鉴定，2株为屎肠球菌（Enter⁃coccus faecium）、1株为肠球菌PNS-E3（Entercoccus PNS-E3），且均确定到种。对分离得到的5个厌氧菌株进行生化试验，最终将此5个菌落中1株确定到种，为粪便拟杆菌（B stercoris）；4株确定到属：1株为乳杆菌属（Lactobacillus brevis）、3株为双歧杆菌属（Bifidobacterium）。

经鉴定，粪便样品分离到的菌落与周围土样样品分离到的菌落仅有一种共同的菌落，即大肠埃希菌（Escherichia coli），提示试验过程中以去除了粪便表面的部分为样品来源具有可行性。

2.3动物药敏试验结果本次试验选取了红霉素（15 μg/片）、青霉素G（10 μg/片）、头孢唑啉（30 μg/片）、呋喃妥因（300 μg/片）、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶（复合）（23.75 μg/1.25 μg/片）、克林霉素（20 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、头孢他啶（30 μg/片）、环丙沙星（50 μg/片）这9类抗生素药敏纸片，研究显示，10种肠道菌对9种药物呈现出不同程度的药物敏感性（见表2）。即10种菌都对呋喃妥因、环丙沙星敏感，对克林霉素产生了耐药性；5种致病菌都对磺胺甲噁唑/甲氧苄啶（复合）敏感；屎肠球菌、肠球菌、乳杆菌、双气杆菌4种革兰阳性菌对青霉素G敏感，对氯霉素、红霉素和头孢他啶产生了耐药性；大肠埃希菌、志贺菌、阴沟肠杆菌、伪产碱单胞菌、摩氏摩根菌5种革兰阴性菌对氯霉素和头孢他啶敏感，对青霉素G产生了耐药性。

3　讨论

了解健康动物消化道内菌群结构，可以监测异常生理状态以及预防疾病的发生，完善野生动物的保护措施。目前研究者针对大熊猫、朱鹮、鱼类等野生动物肠道微生物种类有一定的研究，对于制定合理的保护举措提供了一定的参考。鲍楠[6]等从大熊猫粪便中分离鉴定了12种细菌，依次为鼠李糖乳杆菌、短乳杆菌、多黏芽孢杆菌、耐久肠球菌、两歧双歧杆菌、四联消化链球菌、稍变棒杆菌、面包乳杆菌、大肠埃希菌、变形杆菌、奇异菌、梭菌。史怀平[7]从朱鹮粪便中分离鉴定了22种细菌，对其中的9种乳酸菌进行抑制大肠杆菌试验，发现两歧双歧杆菌、最小双歧杆菌、马里乳杆菌、瑞士乳杆菌及乳酸链球菌对大肠杆菌有明显的抑制作用，其中最小双歧杆菌抑菌效果最好，可适合选做微生态制剂的菌种。颜秉秉[8]等从团头鲂肠道中分离纯化到4株细菌，均为革兰阴性直杆状菌，分别为鲶鱼爱德华菌、摩氏摩根菌、嗜线虫致病杆菌、弗氏志贺菌。本试验中分离到埃希大肠杆菌、志贺菌、阴沟肠杆菌、伪产碱假单胞菌和摩氏摩根菌5种好氧菌群；屎肠球菌、肠球菌两种兼性厌氧菌；粪便拟杆菌、乳杆菌、双歧杆菌3种厌氧菌群，但是仍有一些肠道常见菌群（如韦荣球菌、梭杆菌、葡萄球菌、酵母菌等）未能检出。经分析可能的原因为：（1）各地区的养殖条件、地理环境、水土成分等不一样，造成滇金丝猴的肠道菌群的不同，特别是圈养滇金丝猴，长期生活在一个固定的环境，它们采食的无脊椎动物单一，导致胃肠道内的菌群长期处于一个比较固定的动态平衡中；（2）此外，取样滇金丝猴为人工饲养，饮食结果单一，可能对肠道菌群的多样性有一定影响。

本次试验选取的滇金丝猴是圈养的，在临床少见抗生素的使用及滥用，因此试验中选择的临床常用的抗生素，药物反应依旧表现敏感。但是分离出的5种致病菌均对青霉素G、克林霉素均产生了耐药性，是因为这5种菌均为革兰阴性菌，而革兰阳性菌通常对青霉素类、克林霉素等高度敏感，革兰阴性菌对第3代头孢菌素（头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松等）、氨基糖苷类（庆大霉素、妥布霉素等）高度敏感，对链霉素、头孢菌素类和第2代头孢菌素也较敏感。

[1]龙勇诚，钟泰，肖李.滇金丝猴地理分布、种群数量与相关生态学的研究[J].动物学研究，1996，17（4）：437-441．

[2]黄恭情.野生动物疾病及防治[M].北京：中国林业出版社，2001.

[3]Shen J，Zhang B R，Wei G F，et al.Molecular profiling of the Clostridium leptum subgroup in human fecal microflora by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis and clone library analysis [J].Appl Environ Mierobiol，2006，72：5232-5238.

[4]王凯.断奶前后健康仔猪与腹泻仔猪粪便菌群的比较研究[D].北京：中国农业大学，2007．

[5]布坎南RE.伯杰细菌鉴定手册[M].8版，中国科学院微生物研究所，译.北京：科学出版社，1984：382-462．

[6]鲍楠，刘成君，谭志，等.野外放归大熊猫肠道菌群变化的研究[J].畜牧与兽医，2005，37（8）：10-13．

[7]史怀平，杨增岐，操胜.健康朱鹗消化道正常菌群的分离与鉴定[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36 （3）：69-74．

[8]颜秉秉，吕爱军，骆伟洁.团头鲂肠道细菌的分离鉴定与药敏试验[J].中国畜牧兽医，2010，37（12）：164-167．

Species Identification and Drug Sensitivity Study of Fecal Bacteria fromRhinopithecus bieti

HUANG Xiao-lan1，LI Su-hua1，YIN Hong-bin2，XU Jie3，WU Yue1
（1.College of Life Sciences，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China；2.Yunnan Animal Health Inspection，Kunming 650051，China；3.Department of Veterinary Medicine，Rongchang Campus，Southwest University，Chongqing 402460，China）

In this study，the selective medium was used to isolate and identify the five dominant bacteria strains in fresh feces of Rhinopithecus bieti，and then K-B susceptibility paper method was used to investigate the antibiotic susceptibility.Ten bacteria were isolated and identified by using morphological and cultural characteristics，which included seven aerobic bacteria，Escherichia coli，Shigella，Enterobacter cloacae，Pseudomonas pseudoalcaligenes，Morganella morganii，Entercoccus faecium，Entercoccus PNSE3，and three anaerobic ones，B stercoris，Lactobacillus brevis and Bifidobacterium.K-B susceptibility experiment showed that ten kinds of intestinal bacteria displayed distinct susceptibility to erythromycin，penicillin G，cefazolin，nitrofurantoin，sulfamethoxa⁃zole/trimethoprim（composite），clindamycin，chloramphenicol，ceftazidime，and ciprofloxacin.

Rhinopithecus bieti；fecal bacteria；isolation and identification；antibiotic Susceptibility

LI Su-hua

S865.1+6

A

0529-6005（2016）07-0092-03

2015-07-31

云南省生物多样性基金资助项目；云南省优势特色重点学科生物学一级学科建设项目（50097505）

黄小兰（1990-），女，硕士，研究方向为动物生态学，E-mail：1067716681@qq.com

李素华，E-mail：li.suhua@hotmail.com