乳酸菌作为DNA疫苗载体的研究进展

刘　晶，杨桂连，王春凤，姜延龙

（吉林农业大学动物科学技术学院 吉林省动物微生态制剂工程研究中心，吉林 长春 130118）

乳酸菌作为DNA疫苗载体的研究进展

刘晶，杨桂连，王春凤，姜延龙

（吉林农业大学动物科学技术学院 吉林省动物微生态制剂工程研究中心，吉林 长春 130118）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）属于革兰阳性、兼性厌氧菌，其基因组中GC含量较低，是一类可以利用碳水化合物发酵产生乳酸的一类菌的总称，包括肠球菌、乳杆菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、链球菌和双歧杆菌等众多种属，被广泛地应用于食品发酵、医药生产、保健药物及饲料添加剂等工业，美国食品和药品监督管理局（FDA）将乳酸菌认定为安全的食品级微生物[1]。乳酸菌最重要的特点是具有高度安全性，已成为一种新型载体[2]，替代了像病原微生物、脂质体和微粒子等各种细菌的弱毒菌株之类的载体。

1　乳酸菌表达系统的特点

乳酸菌作为一种原核表达系统，在保证机体安全的前提下，能够发挥持续且高效的免疫力。Pouwels等人[3]的试验表明，乳酸杆菌表达系统可将外源蛋白表达于菌体细胞内，且能诱发针对该抗原的局部或全身黏膜免疫应答，并表明乳酸杆菌作为活菌的疫苗抗原载体能够表现出较高的安全性。LAB之所以能作为极具应用前景的理想抗原呈递载体，原因有以下几点：（1）易培养，且某些菌种可构建出新的表达载体系统；（2）遗传操作方法简便、重复性好且效率高；（3）能保障基因工程产品的相对安全性，构建出可供直接口服的食品级表达系统；（4）具有高度可调控的启动子系统，能表达毒素基因；（5）外源蛋白在细胞内外均可获得良好的表达效果；（6）能够有效引起机体的免疫反应和免疫耐受，且持续时间较长；（7）乳酸菌安全，表达的外源蛋白无需进行纯化，就可直接连同菌体一起服用。

2　DNA疫苗

DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是在分子生物学技术基础上发展起来的第3代新型疫苗，其生产过程主要是借助基因重组技术，定向构建含病原体抗原基因片段的重组DNA真核表达载体。

2.1DNA疫苗的优点相对于原核表达，DNA疫苗最大的优点是其可以在递送病毒或寄生虫抗原的过程中，对抗原表位进行翻译后的糖基化加工，这对某些抗原表位的构象非常重要，而原核表达系统中没有糖基化过程，因此更适用于原核病原菌。

2.2DNA疫苗的不足 作为一种基因调控手段，DNA疫苗必需携带外源基因，外源基因导入机体后，存在激活宿主内源性原癌基因或使宿主抑癌基因失活的可能性，并且疫苗具有较低的免疫原性[4]，还能引发机体产生抗DNA抗体，人们已检测出DNA疫苗并没有相关整合到宿主细胞的基因组[5]。

3　乳酸菌在DNA疫苗中的作用

乳酸菌属于食品级的细菌，其本身可作为DNA疫苗载体，但无侵入能力，因此递送DNA的能力不强；而一些弱致病菌如减毒沙门菌由于其可侵入到细胞中，可以更好的递送DNA。因此可模拟病原菌的侵入过程，构建侵入型重组乳酸菌，使其具有更好的递送能力。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是一种较为典型的乳酸菌，由于其没有致病性，所以较安全。乳酸乳球菌可以大量产生并递送抗原及细胞因子，最近已成为口服DNA疫苗的运载工具。为了增加DNA的递送能力，科研人员对乳酸菌进行了改造以期获得具有侵入能力的乳酸菌。金黄色葡萄球菌是一种具有侵入宿主细胞能力的病原菌，研究表明其细菌表面表达的纤连蛋白结合蛋白A（FnBPA）对其侵入能力至关重要[6]，因此在乳酸乳球菌中表达外源FnBPA后将使乳球菌本身获得侵入细胞的能力。此外，一种被称作pValac的新型质粒也可在乳酸菌中进行表达，进而成为构建真核DNA疫苗的一种载体，这种新型质粒包括巨细胞病毒启动子（pCMV）和来自牛生长激素（BGH）中的聚腺苷酸化序列（polyA）两个部分。科研人员将含有绿色荧光蛋白（GFP）的pValac质粒分别转染至PK15及Caco-2细胞中并获得了表达[7]。由于乳酸乳球菌没有定植能力，因此只能在黏膜水平上对蛋白质进行加工传递[8]，并且乳酸乳球菌在体内和体外[9]均能将功能完整的质粒递送到真核细胞中。为了进一步提高乳酸菌的细胞侵入能力，科研人员在乳酸乳球菌中表达了外源蛋白FnBPA和InIA（产单核细胞内化蛋白），并通过体内试验和体外试验检测FnBPA及InIA的表达情况。试验结果表明，外源侵入型蛋白的表达有效增强了乳酸菌的细胞侵入能力。Danie⁃la Pontes和Silvia Innocentin等人[10]已证明了表达FnBPA的乳酸菌菌株FnBPA+是体内传递质粒的最佳选择载体，而且不管是在体内的胃肠道中还是在体外细胞中，表达了FnBPA或InIA的乳酸乳球菌都能提高质粒的转移效率[11]。

乳酸菌中另一典型的菌种则是乳杆菌属中的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），此菌具有免疫调节作用，同时具有佐剂的特性[12]。之前有研究表明，植物乳杆菌能够对医学上重要的蛋白质进行改进，并且能够以多种方式对其进行表面锚定。由于乳酸菌能够将cDNA递送到宿主细胞，因此为了提高乳酸菌递送DNA的能力，Michon Christophe和 Katarzyna Kuczkowska等人[13]构建了表面锚定表达针对DEC-205的重组单链抗体（aDec）的植物乳杆菌。DEC-205是位于树突状细胞（dendritic cells，DCs）表面的一个受体。其特异性抗体在乳杆菌表面表达能增强乳杆菌对DC的靶向作用及结合能力，从而提高cDNA向DC的传递能力。无论是在体外的细胞中还是在体内的胃肠道中，aDec在菌种表面上的表达都能提高质粒由乳酸菌进入到树突状细胞的传递效率。

针对上述对乳酸乳球菌和植物乳杆菌的介绍，可见构建一种侵入型的乳酸菌，使其作为DNA疫苗的载体，这对DNA疫苗传递载体的选择至关重要。

4　乳酸菌作为DNA疫苗载体的优势

使用乳酸菌作为DNA疫苗载体具有以下几点优势：（1）口服DNA疫苗载体能够通过诱导局部的IgA免疫反应产生特异性保护对抗食物过敏；（2）与裸质粒DNA的免疫进行对比，不需要进一步的质粒扩增和纯化，能够降低成本和劳动；（3）乳酸菌是食品级的细菌，与类似的传递病原体的系统相比，能传递只编码所需抗原的基因；（4）可避免像减毒沙门细菌作为疫苗载体的一些缺点。

5　展望

自从乳酸菌的第一次报道至今已有20多年历史，关于乳酸菌作为疫苗载体的许多研究均有报道。大多数研究者使用乳酸菌作为外源蛋白载体对人体进行免疫，从而抵抗通过消化道和呼吸道黏膜进入人体内的病原体。由于DNA疫苗与传统疫苗相比没有主动侵入性，是一个依赖载体的被动俘获过程，因此可模拟病原菌的侵入过程，从而能更好的将DNA递送到细胞内。可见乳酸菌作为DNA疫苗载体具有很好的研究价值[14]，将会成为未来研究热点。

[1]任晟诚，艾春青，张秋香，等.乳酸菌作为黏膜重组疫苗呈递载体的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2014，5（4）：983-989.

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[3]郭衍冰.树突状细胞诱导肽重组NDV HN基因乳酸菌的制备及免疫效果检测[D].长春：吉林农业大学，2014.

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Q78文献标志码：A

0529-6005（2016）07-0067-02

2015-08-10

国家863计划项目（2013AA102806，2011AA10A215）；国家自然科学基金项目（31272552，31272541）；吉林省科技发展计划项目（20111816）；吉林省世行贷款农产品质量安全项目（2011-Y07）

刘晶（1991-），女，硕士生，研究方向动物微生态与黏膜免疫学，E-ail：1558755144@qq.com

姜延龙，E-mail：yjiang81@126.com