类胰蛋白酶在过敏性疾病诊断中的研究进展

黄玉萨， 谢家骏， 胡风丽（上海中医药大学药物安全评价研究中心，上海201203）



类胰蛋白酶在过敏性疾病诊断中的研究进展

黄玉萨， 谢家骏*， 胡风丽
（上海中医药大学药物安全评价研究中心，上海201203）

类胰蛋白酶属于肥大细胞和嗜碱性粒细胞的特异性活性物质，当激活时以肥大细胞脱颗粒形式与其它介质一起释放，具有促进气道的修复、调节气道平滑肌细胞的张力和反应性、刺激肥大细胞的活化等作用，与支气管哮喘、慢性荨麻疹、过敏性休克、全身过敏反应等病情相关，在中药注射剂过敏性疾病的鉴别诊断中起重要作用。本文主要从类胰蛋白酶的分子生物学基础、功能、生物稳定性、检测方法及其对过敏性疾病的诊断等方面进行了综述，以期为类胰蛋白酶作为生物标志物在诊断过敏性疾病中的应用提供参考。

类胰蛋白酶；肥大细胞；过敏；中药注射剂

类胰蛋白酶是一种中性蛋白酶，主要存在肥大细胞和嗜碱性粒细胞分泌颗粒中，当肥大细胞脱颗粒时，类胰蛋白酶随其他介质一起释放，参与过敏性炎症过程。目前，对类胰蛋白酶分子生物学基础及功能的研究已比较充分，类胰蛋白酶具有促进气道的修复、调节气道平滑肌细胞的张力和反应性、刺激肥大细胞的活化等［1］作用。鉴于类胰蛋白酶的上述生理特性以及在体液中半衰期较长的特点，近年来，其在肥大细胞相关疾病诊断中的应用已受到越来越多的关注。本文主要从类胰蛋白酶的分子生物学基础、生物稳定性以及过敏性疾病诊断等方面对相关文献进行综述，以期为类胰蛋白酶作为生物标志物在过敏性疾病诊断中的应用提供参考。

1　类胰蛋白酶的分子生物学基础

类胰蛋白酶是一种30～35 kDa的中性丝氨酸糖蛋白，主要存在肥大细胞中，嗜碱性粒细胞中虽也少量含有，但仅为肥大细胞含有量的0.2%［2］。另外，类胰蛋白酶是肥大细胞中最主要的酶，含有量高达20%［3］。肥大细胞类胰蛋白酶主要有两类基因编码：α类胰蛋白酶和β类胰蛋白酶基因［4］。肥大细胞有两种分型：黏膜肥大细胞 （MCT）和结缔组织肥大细胞（MCTC），α和β类胰蛋白酶mRNA在MCT和MCTC都有表达。由于体内没有α前体蛋白的处理机制，α前体蛋白没有酶活性。体外成熟α类胰蛋白酶重组体的情况表明，即使在体内形成了成熟的α类胰蛋白酶，它对小分子合成底物仍没有酶活性及蛋白水解活性［5-6］。

成熟的β类胰蛋白酶以具有酶活性的蛋白多糖、肝素结合四聚体形式存在于分泌颗粒中［7］。所有酶活性位点位于二维四聚体的中心，该结构限制了抑制剂或底物的接近，解释了其对生物抑制剂抵抗的现象［8］。肥大细胞静止时只能自发分泌前体类胰蛋白酶，受到激发时才会释放成熟的类胰蛋白酶［5］。

2　类胰蛋白酶的功能

每个肥大细胞里活性类胰蛋白酶的量为10～35 pg。由于类胰蛋白酶四聚体通过丝氨酸蛋白酶的生物抑制剂抑制［8］，它释放到体内后活性调控机制尚不十分清楚。碱性蛋白如抗凝血酶III能使类胰蛋白酶从肝素中解离，从而使肝素中的类胰蛋白酶活性降低，其过程是缓慢而不完全的。β类胰蛋白酶在pH 6条件下降解纤维蛋白原的速率比pH 7.4条件下快了将近50倍［9］。近似的酸性pH更适于β前体类胰蛋白酶的加工及肺部来源的类胰蛋白酶分解［10］。因此，在酸性环境下 （哮喘患者气道表面，炎症位点等）β类胰蛋白酶释放更适于水解蛋白质，在中性环境下β类胰蛋白酶释放会导致蛋白水解活性下降。在中性pH环境下，β类胰蛋白酶从稳定的聚阴离子如肝素解离后，从有活性的四聚体转变为无活性的单体。将无活性的类胰蛋白酶单体置于酸性环境下会使这些单体重组成具有催化活性的四聚体［11］。活性四聚体重构的机制在于无活性的单体和有活性单体之间的相互转化［12］。

蛋白酶激活受体（protease activate receptors，PARs）是丝氨酸蛋白酶受体，包括PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4，其中，PAR-2广泛分布于人体器官中，如：胃肠道、胰、肾、肝、气道、前列腺、卵巢和眼睛等，同时，也发现它存在于内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞系、中性粒细胞和其他人类细胞中。在过敏反应性疾病的研究中发现，PAR-2与过敏反应密切相关。有些疾病动物模型试验结果表明PAR-2激活能引起呼吸道的过敏性炎症反应，但另一些则表明其在过敏性疾病中有保护作用［13］。PARs在皮肤过敏中也有一定的作用，在PAR-2缺陷小鼠免疫细胞如中性粒细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的浸润被显著抑制［14］。为了明确免疫细胞表达的PAR-2和分泌的蛋白酶的在特应性皮炎发生发展中的作用，有必要在临床研究中应用蛋白酶抑制剂和PAR-2拮抗剂。

3　类胰蛋白酶的生物稳定性

速发型过敏刺激时，类胰蛋白酶在血液中的质量浓度一般在致敏后1～2 h达高峰，迟缓型过敏刺激时如食物过敏在血液中的达峰时间为30～60 min。类胰蛋白酶由于其在血液循环系统清除的半衰期约为2 h，按照升高的峰值可能在血液循环系统维持数小时。若高峰值在100 ng/mL的类胰蛋白酶，6 h后血液水平约为10 ng/mL，而高峰值在800 ng/mL，血液水平回到10 ng/mL则需12 h。800 ng/mL是目前观察到的系统性过敏患者的血清最高水平。当类胰蛋白酶体外保存在-20℃或者更低温度时它的免疫反应性至少能保持一年［15］。

类胰蛋白酶的降解途径至今还不十分清楚。Michae1等研究显示，在系统性肥大细胞增多症或特发性过敏反应患者中，类胰蛋白酶的消除并不是经血入尿［16］。另外，Kitoh也表明，在肾病晚期患者中，类胰蛋白酶也未经过尿液途径消除。在肾机能不全和干细胞因子减少的病理状态下，由于肾脏滤过功能的障碍，机体可能通过其他机制影响类胰蛋白酶在血浆中的水平［17］。类胰蛋白酶水平在循环系统的调节机制尚需要研究。

4　类胰蛋白酶的临床检测

类胰蛋白酶主要存在肥大细胞中，血液中含有量很低，不易检测。但是当过敏引起肥大细胞脱颗粒时，类胰蛋白酶大量被释放，血液类胰蛋白酶含有量急剧增多。近年来，继传统比色法后，很多新的检测方法相继出现，测定体液中的类胰蛋白酶含有量的方法具体介绍如下。

4.1酶联免疫分析（ELISA） 采用不同种属的单克隆抗体和类胰蛋白酶抗原抗体反应对类胰蛋白酶进行免疫分析。抗类胰蛋白酶抗体B12（mAbB12）作为一抗，用生物素化的G5单克隆抗体 （mAbG5）可检测成熟的类胰蛋白酶，对于成熟的自然和重组形式的α及β类胰蛋白酶，只有mAbG5能识别其中的线性抗原决定簇；总类胰蛋白酶 （包括前体及成熟的α、β类胰蛋白酶）则可以用G4单克隆抗体 （mAbG4）进行检测。成熟类胰蛋白酶的检测（mAbB12，mAbG5）通常采用ELISA进行测定［18］。

4.2荧光酶联免疫分析 （FEIA） 此法用来检测样本总的类胰蛋白酶含有量，可采用ImmunoCAP全自动过敏源检测仪进行检测，目前已经商业化。抗类胰蛋白酶抗体预先结合在ImmunoCAP固相载体中，37℃孵育，与血液样本中的类胰蛋白反应，形成类胰蛋白酶ImmunoCAP抗类胰蛋白酶复合物，洗脱；加入酶标二抗，形成酶标二抗、抗类胰蛋白酶抗体与待测类胰蛋白酶的复合物，再次洗脱；加入底物，产生酶催化荧光产物；终止液终止反应，测定荧光值。根据标准曲线计算血清类胰蛋白酶含有量 （μg/L）［19］。

4.3类胰蛋白酶活力测定 类胰蛋白酶具有与胰蛋白酶类似的特点，能催化水解赖氨酸和精氨酸羧基所形成的肽键，常见于体外检测；采用专一性底物［20］Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐（BAPNA）。以20 mg BAPNA溶于1 mL二甲基亚砜中，取20μL加入0.65 mL反应缓冲液为Tris·HC1（盐酸三羟甲基氨基甲烷，0.1 mo1/L，pH 7.4）中震荡混匀，加入待测液 （血清等）100μL震荡混匀，30℃反应30 min后，加入0.25 mL 30%乙酸终止反应。酶标仪405 nm测光吸收值。配制胰蛋白酶标准溶液，描记标准曲线，计算类胰蛋白酶的含有量。

4.4免疫组织化学分析 对于组织石蜡切片，可通过免疫组化法检测肥大细胞颗粒内及细胞周围的类胰蛋白酶，通过图像分析系统，观测类胰蛋白酶的分布及半定量，同时还可间接地判断肥大细胞的激活情况，有助于判断发生的过敏反应的类型［19，21］。

4.5免疫印迹（Western b1ot） Western b1ot分析肥大细胞特征性蛋白酶类胰蛋白酶在各个脏器组织中的表达水平。可选GADPH（人磷酸苷油酸脱氢酶）为内参照，在34 kDa左右表达类胰蛋白酶［22］。

5　类胰蛋白酶对过敏性疾病的诊断

5.1支气管哮喘 支气管哮喘简称哮喘，一直被认为与I型变态反应密切相关，而肥大细胞是介导I型变态反应的重要成分之一。肥大细胞经FceRI受体依赖性途径激活后释放大量炎症性介质，其中类胰蛋白酶可引起嗜酸性粒细胞趋化和增殖，参与哮喘等疾病的慢性炎症反应［23］。谢华等［24］分别对30例健康人、哮喘急性期中度和重度患者进行类胰蛋白酶测定，结果显示急性期哮喘组血浆类胰蛋白酶值（2.8μg/L）与对照组（1.2μg/L）比较显著升高（P＜0.05）。朱丽君等［25］对23例哮喘青春期缓解患者、15例哮喘青春期患者和29例正常人进行吸入性过敏原的类胰蛋白酶检测，3组类胰蛋白酶测定结果比较，有显著差异 （P＜0.01），哮喘青春期缓解组血浆类胰蛋白酶增高率明显低于哮喘组，但又明显高于正常对照组。陈丽萍［26］分别对45例健康儿童、哮喘急性期中度和重度患儿进行类胰蛋白酶测定，结果显示，急性期哮喘患儿血浆类胰蛋白酶值（2.65μg/L）与对照组（1.24μg/L）比较明显升高（P＜0.05），缓解期哮喘患儿血浆类胰蛋白酶值（1.75μg/L）与急性期（2.65μg/L）比较明显降低（P＜0.05）。许以平等［27］检测了36例哮喘患者及29例健康人血浆中激活肥大细胞的特征性标志物类胰蛋白酶值，发现哮喘组血浆类胰蛋白酶的增高率为36.11% （13/36），明显高于健康组的10.34% （3/29）。

随着类胰蛋白酶与哮喘疾病关系认识的提高，近年来有学者尝试采用类胰蛋白酶抑制剂对过敏性哮喘进行治疗。类胰蛋白酶抑制剂种类很多，APC366是一种竞争性抑制剂，特应性哮喘患者吸入APC366后，哮喘反应明显减弱［28］。类胰蛋白酶抑制剂可降低哮喘患者对吸入性过敏原的哮喘样反应［29］。肝素以离子键与肥大细胞β类胰蛋白酶相结合，能使类胰蛋白酶具有酶活性的四聚体状态更加稳固，因此，很多研究者也在积极寻找针对肝素的类胰蛋白酶抑制剂。聚凝胺（po1ybrene）和鱼精蛋白（protamine）临床上被用于手术后中和肝素，恢复血液正常功能，对人肺类胰蛋白酶和重组小鼠类胰蛋白酶有强效抑制作用，可用于肥大细胞介导的哮喘的治疗［30］。

5.2过敏性休克 过敏性休克，尤其是药物过敏性休克，发病突然，难以预见，严重者危及生命。1989年，Schwartz［15］等发现在过敏性休克后1～2 h，类胰蛋白酶水平显著升高，4 d后，仍能在血清 （血浆）中检出类胰蛋白酶，提示类胰蛋白酶可作为过敏性休克的指标，为临床诊断与治疗提供依据。林屹［31］应用类胰蛋白酶免疫组化染色方法观察了30例过敏性休克致死和8例非过敏性休克致死病例的脏器，发现在非过敏原因致死的病例中，肺、肠等组织未见类胰蛋白酶染色阳性细胞；过敏性休克致死病例中，肺组织内见大量类胰蛋白酶染色阳性细胞，在支气管黏膜上皮细胞也可见类胰蛋白酶染色阳性颗粒。郭薇等［32］建立豚鼠异种血清过敏性休克模型，采用专属性底物BAPNA对模型鼠的血清、肺、气管类胰蛋白酶活力进行测定，结果显示，过敏性休克豚鼠在血清、气管、肺中类胰蛋白酶活力明显高于对照组。沈忆文等［33］对3例过敏性休克死亡者进行类胰蛋白酶检测，其中2例血清类胰蛋白酶的含有量分别为52 ng/mL和血清（血浆）121 ng/mL，高于正常值10倍以上。米丽等［34］对大鼠过敏性休克死亡动物模型进行类胰蛋白酶测定，结果发现类胰蛋白酶水平明显高于对照组。血清类胰蛋白酶在室温条件下可随保存时间的延长（72 h内）呈升高趋势 （P＜0.05），而在冷藏条件下，类胰蛋白酶随时间无明显变化 （P＞0.05），提示冷藏保存更利于类胰蛋白酶的稳定。

5.3慢性荨麻疹 慢性荨麻疹 （CU）［35］是一种过敏性炎症反应，症状的产生主要由肥大细胞和嗜碱性粒细胞活化后释放的组胺、蛋白水解酶以及合成和分泌的化学递质、细胞因子所引起。Ferrer等［36］对81例慢性荨麻疹患者血清检查中发现，类胰蛋白酶含有量为 （6.6±4.1）μg/L，与正常对照组 （4.4±2.2）μg/L相比，差异具有统计学意义。2001～2002年，沈志鸿等［37-38］先后对43例慢性荨麻疹患者和58例正常人进行类胰蛋白酶检测，发现慢性荨麻疹患者类胰蛋白酶水平及阳性率与正常对照组比显著提高（P＜0.01）。任华丽［39］报道1例肺癌患者静脉点滴白介素-2（IL-2）后30min出现全身性荨麻疹，急性期 （发病3 h）及缓解期（第7天）类胰蛋白酶水平分别为17.0μg/L和5.46μg/L，相差近3倍。国外学者Hidvégi［40］对50例CU患者外周血中类胰蛋白酶含有量进行测定，发现其平均值为7.1μg/L，其增高的水平与荨麻疹的病情严重程度成正相关。

5.4全身过敏反应 研究发现，急性全身性过敏反应发生后，血清中类胰蛋白酶的含有量明显升高［19］。任丽华等［41］对7例严重全身过敏反应急性发作期进行类胰蛋白酶检测，平均类胰蛋白酶水平为 （17.4±7.87）μg/L，与正常人（4.36±1.67）μg/L相比，显著升高 （P＜0.01）。Lin等［42］对97例急性严重过敏症状患者进行研究，其中有20例血清类胰蛋白酶质量浓度升高 （＞15μg/L）。程芳［43］采用大鼠尾静脉注射双黄连注射液，给药后5 min取血，结果显示，双黄连注射剂高剂量组 （800 mg/kg）的血清类胰蛋白酶水平明显高于生理盐水对照组 （P＜0.05）。夏赞韶［44］采用大鼠尾静脉注射不同剂量的双黄连注射液（200、400、800mg/kg），给药后10min各剂量给药组大鼠血清类胰蛋白酶质量浓度均呈明显升高，且其质量浓度变化趋势与给药剂量呈正相关，其中高剂量组类胰蛋白酶质量浓度达 （394.4±82.3）ng/mL。李中港等［45］在对不同品系大鼠Ⅰ型超敏反应敏感性的比较中发现，BN大鼠在注射给予卵清蛋白溶液10、20、40μg/kg和Wistar大鼠在注射给予卵清蛋白溶液40μg/kg剂量下，血清类胰蛋白酶质量浓度均显著性升高 （P＜0.01）。杨剑婷等［46］对白果蛋白过敏试验研究中发现，给予白果蛋白后，小鼠血清类胰蛋白酶活性显著升高 （P＜0.01）。因此，类胰蛋白酶可以作为中药注射剂类过敏反应和I型超敏反应检测体系中重要的评价指标。

另外，类胰蛋白酶指标在中药注射剂过敏性评价体外试验中也有重要的作用。郭永超等［47］用虾过敏原蛋白和氢氧化铝佐剂致敏BALB/c小鼠，取其抗体血清后与肥大细胞共孵育，2 h后加入虾过敏原溶液进行激发，发现上清液中类胰蛋白酶的检出量和阳性血清质量浓度呈现剂量依赖性升高，和阴性对照组相比有明显的统计学差异 （P＜0.05）。

5.5其他 张仲林等［48］观察过敏性鼻炎动物模型腹腔肥大细胞释放类胰蛋白酶的影响，结果显示，与空白组比较，模型组类胰蛋白酶表达水平明显升高，且经玉屏风散治疗后，过敏性鼻炎脱颗粒释放类胰蛋白酶表达降低。田道法等［49］研究中药复方加味补中益气汤对过敏性鼻炎的干预效应，发现经药物干预后，胰蛋白酶表达量明显降低，提示加味补中益气汤对于肥大细胞的活化有较强的直接抑制作用。章高平［50］对20例过敏性紫癜肾炎患儿肾活检石蜡切片组织进行β-类胰蛋白酶的检测，结果显示肾组织中β-类胰蛋白酶阳性细胞率与对照组比较差异有显著性 （P＜0.05）。Yunginger等［51］检测8例食物过敏患者的类胰蛋白酶水平，其中6例测定值均高于正常。患者的过敏器官灌洗液或组织中也出现高质量浓度的类胰蛋白酶，如：过敏性眼炎患者的泪液［13］、接触性皮炎患者的皮肤水泡液［13］及风湿病患者的关节囊液［52］。

至今，类胰蛋白酶的发现已有四十多年，其分子生物学基础及功能的研究已比较充分。类胰蛋白酶主要存在于肥大细胞和嗜碱性粒细胞中，稳定性好，且检测方法广泛而简单易行。虽然组胺作为脱颗粒活性物质在诊断鉴别上具有重要的作用，但由于其在血液中半衰期很短，使其作为诊断标志物的适用性受到限制，故类胰蛋白酶在过敏性相关疾病诊断和评价中的作用显得尤为重要。类胰蛋白酶的检测可以作为反映肥大细胞活性的指标，其在血清中的含有量增高与临床症状的严重程度有一定相关，在支气管哮喘、慢性荨麻疹、过敏性休克等疾病诊断中起到重要的作用。如何更好地在过敏性疾病中应用类胰蛋白酶这一指标，提高诊断的准确性，有必要作进一步的研究。

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2016-01-27

国家 “十二五”科技重大专项 （2011ZX09301-009）

黄玉萨 （1990—），女，硕士生，从事中药毒理学研究与安全性评价。Te1：（021）51323053，E-mai1：1026164873@qq.com

谢家骏 （1959—），男，研究员，硕士生导师，从事中药药理毒理学研究与中药新药开发。Te1：（021）51322395，E-mai1：xiejj001@163.com