p53在乳腺癌基因治疗中的研究进展

詹　媛　江锦良　邬黎青

(江西省肿瘤医院病理科，江西　南昌　330029)



p53在乳腺癌基因治疗中的研究进展

詹媛江锦良1邬黎青2

(江西省肿瘤医院病理科，江西南昌330029)

p53基因；信号通路；细胞周期；乳腺癌；基因治疗

全球每年有超过40万的人死于乳腺癌。我国虽是低发地区，但乳腺癌患病率占所有肿瘤的7%～9%，患病人群也呈年轻化发展趋势。研究发现50%的肿瘤存在p53突变，乳腺癌也存在p53异常，p53与肿瘤之间存在密切联系。本文对p53在乳腺癌基因治疗中的研究进展作一综述。

1　p53结构及其特点

1979年Lane和Craword首次用免疫的方法发现猿猴空泡病毒(SV40)感染的NH3T3小鼠细胞核中存在一种物质，它是能与SV40大T抗原相互作用的核酸化核蛋白即p53蛋白，继而发现了p53基因〔1〕。p53分为野生型和突变型两类，前者在维持细胞正常生长，抑制细胞恶性增殖过程中起主要作用，使细胞分裂阻滞在DNA合成前期(G1)/DNA合成期(S)期，使细胞有足够时间修复损伤，阻止细胞将损伤传给子代。而mt-p53失去正常p53的抑癌作用，同时还因突变而具有癌基因的作用〔2〕。

野生p53(wt-p53)基因位于人染色体17p13.1区带,含11个外显子及10个内含子，第1个外显子不参与编码。p53上游400 bp处有启动子p1,下游1 kb处有启动子p2，二者为转录起始点，其启动子不含CAAT盒、TATA盒、GC盒等常见启动序列。p53 基因中有5个高度保守区,其中4个位于外显子5～ 8。它们是突变热点，分别编码132～143、174～179、236～248 和272～281 号氨基酸。wt-p53基因转录为25 kb mRNA然后翻译成393个氨基酸组成的分子量为53 kD的核磷酸化蛋白，其结构有：N-末端的转录激活结构域(1～42氨基酸)是高电荷区，含大量的酸性残基，能与一系列蛋白结构(如p14ARF 和p300)结合，而调节转录功能。信号区(64～92个氨基酸)能诱导细胞凋亡，还有顺序专一的DNA结合结构域(102～292氨基酸)，它能特异性地结合靶基因中的顺势作用元件,调节靶基因转录活性。具有的DNA四聚体化结构域(342～355个氨基酸)能抑制癌细胞增长。C-末端的非专一DNA结合区(370～393个氨基酸)则是与非特异性的DNA序列结合。p53的特殊结构决定了其重要分子生物学特性〔2～4〕。

2　p53基因在乳腺癌中的作用

国外研究报道〔4〕：15%～50%的乳腺癌存在p53缺失，相关研究对中国乳腺癌p53表达做了荟萃分析，结果表明乳腺癌中p53蛋白阳性表达率平均达45%〔5〕，说明p53异常与乳腺癌之间存在紧密联系。作为多种细胞应激及细胞应答的中间环节，p53与基因网络上、下游的各种基因及调控因子构成精细的信号通路，通过细胞凋亡及衰老等方式来维持DNA稳定。若p53发生突变会导致基因组不稳定、损伤的DNA不能修复，那么机体则易形成肿瘤。乳腺癌的发生与p53异常有关，正常乳腺细胞中wt-p53是通过以下途径维持细胞基因组稳定。

p53-鼠双微体蛋白(MDM2)负反馈环路调控是一系列复杂的调节。wt-p53的失活常常是因为MDM2调控的异常，后者是一种E3泛激素连接酶，它编码一种锌指蛋白P90能与p53结合，诱导p53的出核转运、促进泛素化,最终p53被蛋白酶降解〔6〕。MDM2及MDMX(MDM4)具有同源性，MDM2能与p53直接发生作用，而后者虽不能直接作用于p53，但能够增强MDM2活性，间接发挥作用〔6〕。当DNA损伤、离子辐射激活信号通路时，共济失调毛细血管扩张综合征突变基因(ATM)及ATM-RAD3相关基因(ATR)可被激活，进而导致p53及MDM2的磷酸化，使得p53与MDM2相互的结合能力下降，细胞核内p53水平升高。另一条反馈机制肿瘤抑制蛋白p14ARF-MDM2环路〔7〕，它可以抑制p53-MDM2信号途径，升高p53水平。细胞周期相关转录因子(E2F)-1及Myc、Rasp14、Beta-catenin可增加ARF的转录及蛋白表达，从而使ARF与MDM2结合，抑制其E3泛素酶活性、增强p53功能。而p53又能下调ARF转录，形成精细的环路反馈。人体处于紫外线、离子辐射、化学诱变剂、致瘤病原体等复杂的外部环境暴露，导致乳腺细胞DNA发生损伤时，机体可以通过上述通路来维持细胞正常，增强p53抑癌功能，抑制肿瘤形成。倘若机体p53失活，那么乳腺细胞中损伤的DNA则会继续传给子代，最终形成乳腺肿瘤。

p53能激活下游靶基因GADD45、Bax、Puma、p21、Fas，发挥DNA修复、细胞周期阻滞〔8〕、抑制肿瘤血管等功能〔9〕。 GADD45是第一个被检出的 p53下游靶基因，它有生长阻滞及DNA 损伤修复功能。p53为GADD45转录激活物，其编码产物可以参与DNA 修复且抑制DNA 合成〔6〕。它可通过p53依赖及非依赖两条途径参与细胞周期监测点、细胞凋亡等重要细胞生命活动的调节，并通过抑制细胞生长及促进 DNA 损伤修复方式维持基因组稳定性，抑制细胞转化和肿瘤的恶性进展〔10〕。p53还可以激活下游靶基因p21，p21作为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)广泛抑制剂，与细胞周期蛋白(Cyclin)A-CDK2、CyclinD1-CDK4、CyclinE-CDK2复合物结合，抑制其相应蛋白激酶活性，导致Rb不能磷酸化，转录因子E2F不能活化，最终引起G1/S期阻滞，使受损细胞有足够时间修复损伤〔10，11〕。若DNA 的损伤发生在 S期之前，p21 蛋白主要通过与CDK/Cyclin 结合并抑制其功能使细胞周期停滞于 G1期。而发生在S期的损伤，主要是通过p21 与增殖细胞核抗原(PCNA)的相互作用来阻滞细胞周期。p21WAF1/CIP1基因在羧基末端编码一个 PCNA 结合域，p21和PCNA结合可直接抑制DNA的合成。在正常细胞中P21与Cyclin、CDK、PCNA组成四联体使增殖信号不能有效形成，其中包括E2F激活及DNA聚合酶形成，从而发生细胞周期阻滞〔10，12，13〕。

乳腺细胞损伤的DNA未被修复，p53则会启动细胞程序性死亡过程即凋亡来阻止受损DNA遗传给子代细胞。细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动死亡，其中涉及特殊基因激活及细胞发生特征的生化和形态学改变如凋亡小体的形成。目前已发现受p53基因调控与凋亡相关的基因有：Bak、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1、DR5、Bax、Puma、Fas等〔12〕。Bax 是Bcl-2 家族中重要的促凋亡蛋白。Bcl-2基因是近年来新发现的原癌基因，肿瘤细胞凋亡受凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促进基因 Bax 的双向调节，而Bax也属于Bcl-2家族。p53还可以与凋亡刺激蛋白(ASPP)形成复合物，ASPP1和ASPP2是同一蛋白质家族，他们可以促进 p53的细胞凋亡，增强p53与DNA 的结合，促进凋亡基因启动子活化，增强p53的细胞凋亡功能，使细胞发生凋亡〔10，12，13〕。

乳腺癌的生长所需营养物质由血液供应，因此肿瘤需要大量的血管生长。血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成的重要促进因子，是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂原，能促进内皮细胞分裂增殖及血管构建〔7〕。可使血管渗透性升高,血液大分子外渗沉积在血管外组织基质中，为肿瘤生长提供营养支持，同时血管通透性增加也促使肿瘤细胞的浸润转移。一旦停止血液供应，乳腺肿瘤组织就不能生长，甚至退化、坏死。wt-p53能抑制肿瘤血管生长，它通过抑制VEGF的表达，从而抑制血管的生成、降低血管通透性，最终抑制肿瘤恶化〔11〕。

3　p53基因治疗乳腺癌

基因治疗的成功取决于分子生物学发展水平及重组基因技术支持。Seki等〔11〕用基因治疗的方法成功治愈腺苷脱胺酶(ADA)缺乏的患者。Serrano等〔10〕将bcl-2反义寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN)导入耐药的骨髓瘤细胞内,加强化疗药物效果。

逆转录病毒导入是最早开展的基因导入法，由于它操作复杂、感染效率低，且存在重组入宿主基因组生成致病型重组病毒的危险，现已很少使用〔12〕。腺病毒导入法操作简单、感染效率高，现已得到广泛运用，并获得较好的治疗效果。腺病毒介导的p53感染肿瘤细胞后能有效地控制肿瘤细胞生长或引起凋亡〔11〕。中国在2003年首次批准基因治疗药物——p53重组腺病毒药物Gendicine的运用〔11〕。目前它已经用于肿瘤临床治疗乳腺癌、膀胱癌治疗。虽然腺病毒治疗法疗效显著，但也存在一些问题如毒副反应、感染等。目前国内外学者仍在不断研究新的基因治疗方法。基因封闭是基因治疗的新技术，它是运用各种类型的反义分子在基因水平有选择地去封闭有害基因的表达,从而达到治疗疾病的作用，包括RNA干扰(RNAi)〔13〕、ODN、反义RNA、核酶〔14〕等。te Poele等〔12〕体外合成能与p53特异性结合的小干扰RNA(siRNA),用其转染乳腺细胞系MDAH087以治疗肿瘤。Mottolese等〔13〕发现核酶可以令p53下游基因 p21和 Bax的表达激活，促进肿瘤细胞凋亡。这些案例为基因治疗可行性提供有力的说明。研究发现一些作用于p53-MDM2通路的小分子抑制剂如Nutlin-3a、MI-219，能与p53竞争性结合MDM2，从而抑制肿瘤〔15〕。如今p53疫苗研究也进入了实验研究阶段，p53作为外来抗原使机体发挥体液免疫，产生p53抗体，同时激活CD4+、CD8+T细胞，通过细胞免疫来抗肿瘤〔16，17〕。综上，p53突变分析及其信号通路研究为肿瘤治疗提供新的思路。目前针对p53的抗肿瘤药物已经上市、关于基因治疗肿瘤的研究也在不断深入。

1Lvkovic-Kapicl T,Knezevic-Usaj S,Panjkovic M,etal.The influence of aging on pathologic and immunobiologic parameters of invasive ductal breast carcinoma〔J〕.Vojnosanit Pregl,2006;63(11):921-7.

2Li Y,Bhuiyan M,Vaitkevicius VK,etal.Structural alteration of p53 protein correlated to survival in patients with pancreatic adenocarcinoma〔J〕.Pancreas,1999;18(1):104-10.

3Tiguert R,Bianco FJ,Oskanian P,etal.Structural alteration of p53 protein in patients with muscle invasive bladdert ransitional cell carcinoma〔J〕.J Urol,2001;166(6):2155-60.

4Vogelatein B,Lane D,Levine AJ.Surfing the p53 network〔J〕.Nature,2000;408(6810):307-10.

5Harris SL，Levine AJ．The p53 pathway:positive and negative feedback loops〔J〕.Oncogene，2005;24(17)：2899-908.

6Gartel AL，Radhakrishnan SK． Lost in transcription:p21 repression，mechanism，and consequences 〔J〕.Cancer Res，2005;65(10):3980-5．

7Thompson JS,Ling X,Grunstein M.Histone H3 aminoterminus is required for telomeric and silent mating locus repression in yeast〔J〕.Nature,1994;369(6477):245-7.

8Jussila L,Alitalo K.Vascular growth factors and lymphangioegenesis〔J〕.Physiol Rev,2002;82(3):673-700.

9Kimura SH,Ikawa M,Ito A,etal.Cyclin G is involved in G2/M arrest in response to DNA damage and in growth control after damage recovery〔J〕.Oncogene,2001;20(25):3290-300.

10Serrano M,Lin AW,McCurrach ME,etal.Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a〔J〕.Cell,1997;88(5):593-602.

11Seki M,Iwakawa J,Cheng H,etal.P53 and PTEN/MMAC1/TEP1 gene therapy of human prostate PC-3 carcinoma xenografi,using transfemin-facilitated lipofection gene delivery strategy〔J〕.Hum Gene Ther,2002;13(6):761-73.

12te Poele RH,Okorokov AL,Jardine L,etal.DNA damage is able to induce senescence in tumor cells in vitro and in vivo〔J〕.Cancer Res,2002;62(6):1876-83.

13Mottolese M,Dadasi EA,Botti C,etal.Phenotypic changes of p53 Her2,and Fas system in multiple normal tissues surrounding breast cancer〔J〕.Cell Physiol,2005;204(1):106-12.

14Hofland HE,Masson C,Iginla S,etal.Folate-targeted gene transfer in vivo〔J〕.Mol Ther,2002;5(6):739-44.

15Liu Q,Gazitt Y.Potentiation of dexamethasone,paclitaxel,and Ad-p53-induced apoptosis by Bcl antisense oligodeoxynucleotides indrug resistant multiple myeloma cells〔J〕.Blood,2003;101(10):4105-14.

16Yu W,Pirollo KF,Rait A,etal.A sterically stabilized immuno lipoplex for systemic adm in is tration of a therapeutic gene〔J〕.Gene Ther,2004;11(19):1434-40.

17Sanding BV,Brand K,Herwig S,etal.p16 and p53 genes transferred with the help of adenovirus to induce apoptic tumor cell death〔J〕.Ugeskr Laeger,1997;159(46):6825-30.

〔2015-04-09修回〕

(编辑苑云杰/王一涵)

邬黎青(1963-)，女，博士，硕士生导师，主任医师，主要从事乳腺癌研究。

詹媛(1990-)，女，硕士，住院医师，主要从事乳腺癌研究。

R737.9

A

1005-9202(2016)17-4391-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.125

1南昌大学第一附属医院2南昌大学第二附属医院