自发性高血压大鼠脑出血后炎症反应与Th17细胞的相关性

张明石　李晓飞　李明军　毕　胜　王德超

(佳木斯大学附属第一医院神经外科，黑龙江　佳木斯　154002)



自发性高血压大鼠脑出血后炎症反应与Th17细胞的相关性

张明石李晓飞李明军毕胜1王德超2

(佳木斯大学附属第一医院神经外科，黑龙江佳木斯154002)

目的探讨自发性高血压大鼠(SHR)脑出血后炎症反应与Th17细胞的相关性。方法SHR随机分为正常对照组，假手术组和模型组各5只。胶原酶大脑尾状核注射制备大鼠自发性高血压脑出血(HICH)模型。出血后48 h，冰上取脑。流式细胞仪检测脑组织中Th17细胞占CD4+T细胞的百分比；酶联免疫吸附(ELISA)方法检测脑组织上清中白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。结果与正常对照组和假手术组相比，模型组脑组织中Th17细胞数量明显增加，同时IL-6和TNF-α分泌水平明显升高。结论脑出血急性期炎症反应的诱导和发生与Th17细胞的参与密切相关，Th17细胞促进了脑出血后的病理进程；可能部分通过诱导炎性细胞因子IL-6和TNF-α分泌增加实现的。

自发性高血压；脑出血；炎症反应；Th17

在世界范围内，脑卒中是一组发病率、致残率和死亡率均很高的疾病，而高血压脑出血(HICH)的病死率和致残率则居各型脑卒中之首〔1〕，30 d病死率高达38%～52%。脑出血诱发的脑损伤中，四分之一属于炎性反应及补体系统参与的免疫损伤〔2〕。炎症反应(炎性细胞和炎症介质)与继发性脑组织损害密切相关。Th17细胞是新发现的与 Th1、Th2细胞完全不同的CD4+T细胞系，具有独立的分化和调节机制〔3〕。Th17可分泌白细胞介素(IL)-17、IL-21和 IL-22等，在促炎反应和自身免疫病中发挥重要作用。本文观察高血压大鼠脑出血后Th17细胞数量变化特点，直观反映Th17在HICH脑损伤中的作用。

1　材料与方法

1.1实验材料健康自发性高血压大鼠(SHR)，体重250～300 g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物中心提供(合格证：SCKX(京)2002-0003)。适应性喂养2 w，随机分为正常对照组、假手术组、模型组各5只。主要试剂有抗CD3-PE单抗、抗CD4-FITC单抗(GK1.5克隆)、抗IL-17A-APC单抗和抗FcγⅢ/Ⅱ受体抗体(2.4G2克隆)：BD Pharmigen公司(美国)；抗IL-17A mAb：Biolegend公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒：R&D 公司(美国)(MN)；IL-6 ELISA试剂盒：R&D 公司(美国)(MN)；Ⅶ型胶原酶：Sigma公司(美国)。主要仪器有流式细胞仪，BD Aria，美国；酶标检测仪，MoH 99-15，芬兰LM。

1.2模型制作参照徐雅〔4〕的方法：麻醉大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛(0.4 mg/kg)，将大鼠固定于脑立体定位仪并且暴露颅骨〔5〕，钻开颅骨，将0.5 μl胶原酶(含有胶原酶0.5 mg)通过微量注射器垂直注入大鼠脑组织尾状核部位。观察5 min后取出微量注射器缝合。正常组无任何操作，假手术组以等体积的生理盐水进行尾状核注射。

1.3动物处理大鼠出血48 h后断颈，取出全部脑组织并迅速切取尾状核注射针孔前后2 mm脑组织，全部操作需冰上进行。一部分加入适量的3%胎牛血清的磷酸盐缓冲液(PBS)迅速制备单细胞悬液，用于流式检测；另一部分加入预冷生理盐水(0.25 ml/100 mg脑重)迅速匀浆，低温14 000 r/min，离心15 min。取上清-80℃保存，用于细胞因子检测。

1.4流式细胞仪检测CD3+CD4+IL-17+T细胞数量制备脑细胞悬液，CD3-FITC、CD4-PE和IL-17A-APC 三色同时标记，设阴性对照管。取新鲜制备的1×106个脑单细胞悬液加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体预处理的流式专用管，随后加入FITC-抗CD3和PE-抗CD4荧光抗体表面染色，3%胎牛血清(FCS)洗2次，加入固定透膜剂孵育30 min，再加入APC-抗IL-17A 荧光抗体细胞内染色。同时同型对照抗体(FITC)大鼠IgG2b染色。应用FACSCELLQUEST 软件，记录Th17占CD4+T细胞的百分率。

1.5细胞因子检测检测血清中IL-6和TNF-α水平变化，并计算细胞因子含量。可选用双抗体夹心ELISA试剂盒，检测结果以试剂盒提供的标准品绘制，应用Soft Max Pro 4.3.1LS软件分析，标准曲线酶标仪测定450 nm处OD值。

1.6统计学方法应用SPSS11.5统计软件进行t检验。

2　结　果

2.1脑出血48 h后脑组织中Th17细胞数量的变化与正常对照组(0.37%±0.24%)相比，模型组脑组织中CD3+CD4+IL-17+T细胞数量(3.83%±0.43%)明显增加(P<0.01)；与假手术组(0.71%±0.37%)相比也明显增加(P<0.01)。

2.2脑出血48 h后脑组织中IL-6水平的变化与正常对照组〔(3.71±0.38)pg/ml〕相比，假手术组〔(6.37±0.65)pg/ml〕和模型组脑组织中IL-6水平〔(13.16±0.78)pg/ml〕均明显升高(P<0.01)；与假手术组相比，模型组脑组织中IL-6水平也明显升高(P<0.01)。

2.3脑出血48 h后脑组织中TNF-α水平的变化与正常对照组〔(3.77±0.39)pg/ml〕相比，模型组脑组织中TNF-α水平〔(7.81±0.85)pg/ml〕明显升高(P<0.01)；与假手术组〔(4.01±1.00)pg/ml〕相比，模型组脑组织TNF-α水平也明显升高(P<0.05)。

3　讨　论

炎症是一种常见的病理现象，脑出血后血肿及其血肿本身的机械压迫是引发周围组织炎性反应的重要因素。然而炎症反应又是引发继发性脑损伤的必要条件〔2〕。炎性反应一方面可以帮助宿主清除和吸收坏死组织和细胞碎片，修复损伤，是机体正常防御性反应。但其也有不利的一面，即炎性反应过程中会导致多种酶/炎症介质的释放，诱导脑组织周围水肿及神经细胞损伤加重〔6〕。

多位学者研究证实，HICH后在血肿内及血肿周围有炎症反应发生，白细胞的浸润和小胶质细胞的活化诱导了IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症细胞因子的释放，并在48 h达高峰，且能持续1 w〔7〕。IL-6的主要细胞来源包括T、B淋巴细胞、单核细胞和内皮细胞，对于脑组织，星形细胞和小胶质细胞则是IL-6的主要来源，参与HICH后的免疫应答和炎症反应并发挥重要作用，是脑损伤程度及预后的重要监测指标〔8〕。TNF是促炎性细胞因子，单核-巨噬细胞是TNF-α的主要来源。神经细胞、星形细胞和小胶质细胞是中枢神经系统中TNF-α的主要来源，其主要生物学功能包括杀伤肿瘤，调节机体炎症反应及免疫应答。

Th17 细胞是有别于Th1 和Th2 细胞的一种新的CD4+T细胞亚群。Th17分泌的细胞因子包括IL-17、IL-21、IL-22、IL-6和TNF-α等细胞因子，因此Th17细胞被认为是一群介导炎症反应的重要细胞〔9〕。对于Th17细胞的作用机制，通常认为它可以通过诱导其他炎症细胞因子如IL-6，TNF-α及趋化因子如单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-2等的表达，介导炎症细胞到达病变局部，造成组织损伤〔10〕。本研究提示，Th17细胞参与了脑出血急性期炎症反应的诱导和发生，促进了脑出血后的病理进程。可能部分通过诱导炎性细胞因子IL-6和TNF-α分泌增加实现的。但Th17细胞在脑出血发病中的作用机制尚需进一步研究。

1中华神经科学会.各类脑血管疾病诊断要点〔J〕.中华神经科杂志，1996；291(6)：379-82.

2Gong C，Hoff JT，Keep RF.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rats〔J〕.Brain Res，2000；871(1)：57-65.

3Littman DR，Rudensky AY.Th17 and regulatory T cell in mediating andrestraining inflammation〔J〕.Cell，2010；140(6)：845-58.

4徐雅.安工清开灵干预自发性高血压大鼠脑出血模型炎症反应的机制研究〔D〕.北京：北京中医药大学，2007.

5Arvin B，Neville LF，Barone FC，etal.Brain injury and inflammation：a putative role of TNF alpha〔J〕.Ann N Y Acad Sci，1995；765：62-71.

6Del Zoppo GJ，Becker KJ，Hallenbeck JM.Inflammation after stroke〔J〕.Arch Neurol，2001；58(4)：669-72.

7张祥建，李春岩，刘春燕，等.炎症反应与大鼠脑出血后脑损伤的相关性〔J〕.中华神经科杂志，2005；38(6)：396-7.

8Fassbender K，Rossol S，Kammer T，etal.Proinflammtory cytokines in serum of patients with acute cerebral ischemia：kinetics of serection and relation to the extent of brain damage and outcome of disease〔J〕.J Neurol Sci，1994；122(2)：135-9.

9Nurieva R，Yang XO，Martinez G，etal.Essential autocrine regulation by IL-21 in the generation of inflammatory T cells〔J〕.Nature，2007；448：480-3.

10Kolls JK，Linden A.Interleukin-17 family members and inflammation〔J〕.Immunity，2004；21：467-76.

〔2015-02-19修回〕

(编辑苑云杰)

黑龙江省自然科学基金(No.B2015013)

毕胜(1981-)，女，博士，主治医师，主要从事神经免疫学研究。

张明石(1979-)，男，硕士，主治医师，主要从事神经外科学研究。

R743.34

A

1005-9202(2016)17-4146-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.004

1佳木斯大学附属第一医院神经内科2佳木斯大学研究生学院