IL-10+调节性B细胞在自身免疫性疾病中的研究进展①

吴华仙　田广俊　陈曲波

(广州中医药大学第二临床医学院，广州510120)



IL-10+调节性B细胞在自身免疫性疾病中的研究进展①

吴华仙田广俊陈曲波

(广州中医药大学第二临床医学院，广州510120)

近年来，随着业内对B细胞研究的不断深入，一类具有免疫调节功能的B细胞亚群——调节性B细胞(Regulatory B cell，Breg)逐渐被认识。类似于调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)，Breg在维持外周免疫耐受的过程中起关键作用。1996年人们首次在自身免疫性脑脊髓膜炎的小鼠模型中发现了Breg，并在随后的一系列疾病研究中发现Breg可能由Toll样受体(TLRs)、CD40L等多种因素刺激活化，通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子发挥免疫调节的作用。越来越多的研究表明，Breg与炎症、感染、癌症、移植及自身免疫性疾病等均具有密切联系。本文就Breg与自身免疫病的最新研究进展作一综述。

1Breg的生物特性

1.1Breg的来源与活化依据表面CD分子不同将成熟B细胞分为B1细胞和B2细胞。B2细胞主要分布在周围免疫器官，为通常所指的B细胞，是执行体液免疫的主要细胞； B1细胞属于固有免疫细胞,主要分布在腹腔和胸腔，与机体的免疫调节、自身免疫病及B细胞源性肿瘤密切相关，能有效提高对凋亡细胞的清除率[1]。早期研究表明分泌IL-10的Breg(B10)主要来源于腹腔的B1细胞，经IL-12的刺激可以产生IL-10。之后，有研究者提出Breg细胞来源于幼稚滤泡型B细胞(Follicular B-cell，FOB)，是经CD40及BCR的刺激诱导产生的。Dalwadi[2]则发现具有免疫抑制功能的Breg细胞可能来源于边缘区B细胞(Marginal zone B-cell，MZ B)或者边缘区前体B细胞(Transitional 2 marginal-zone precursor B-cell,T2-MZP)，且进一步指出在Breg发育活化中Gαi2是不可缺少的 。而随后的研究证实CD19的表达以及TLRs的刺激也可以诱导Breg的发育活化[3,4]。也有文献指出Breg发育过程中需要在IL-21以及CD40依赖的同源T细胞的刺激下，才具备分泌IL-10的能力[5,6]。Matsumoto等[7]则在EAE小鼠引流淋巴结中指出CD138+浆母细胞是分泌IL-10主要场所，并指出转录因子Blimp1与IRF4影响CD138+浆母细胞(B10)调控功能的发挥。最新研究发现分泌IL-35的Breg(IL-35+Breg)主要来源于脾脏的CD138+浆母细胞，同时指出其发育活化需要TLRs与CD40[8,9]。

1.2Breg的表型尽管对于细胞表面标志认识众多，但有关Breg独特的表面标志的研究至今尚不完整。细胞表面标志物对于确定Breg具有关键性的作用。在动物和人类体内，典型的Breg都具备分泌IL-10并且表达CD19的特性。在小鼠模型中，Breg的表面标记主要有：CD1dhi、CD5+、CD24hi、CD23-、CD93hi、IgDhi、CD138+、CD11blow等。人类Breg表型的确定也主要基于IL-10的分泌，它在表型与功能上表现出与小鼠中Breg相似的情况。有关人类Breg的研究主要集中在系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)等自身免疫性疾病。Iwata等[10]在人体研究中发现Breg主要的表型是CD24hiCD27+。这一群细胞可以通过分泌IL-10，抑制TNF-α的分泌来发挥免疫抑制功能。同时还发现了一些其他的Breg表面标记物：CD20、CD21、CD23、CD25、CD27、CD38等。另一文献报道在SLE患者体内主要的Breg表型是CD24hiCD38hi，并证实了这一群B细胞存在功能缺陷[11]。Lindner[12]的研究证实了在实体瘤患者体内存在表型为CD19+CD5+GzmB+的B细胞亚群，可以抑制CD4+T细胞的增殖。其他研究还发现如下Breg表型：CD48hiCD148hi、CD24hiCD148+、CD19+CD5+、CD19+CD24hiCD27int、CD19+CD24hiCD71hi。

1.3Breg的功能及调节机制大量体内外的Breg的研究都表明：分泌IL-10是Breg发挥免疫抑制作用的关键因素。Breg通过分泌IL-10不仅可以有效地抑制自身反应性CD4+T细胞分泌TNF-α与IFN-γ，而且可以调控DC细胞的抗原提呈的能力及其他细胞因子的产生。值得注意的是：在体外刺激下，并不是所有的Breg都是通过表达IL-10发挥调控作用。Huynh提出[13]：TGF-β是Breg发挥免疫调节作用的另一途径，其可以诱导Th1凋亡、抑制APC的抗原提呈能力以及可抑制巨噬细胞的分化。Shen等[8]发现一群以分泌IL-35进行免疫调节作用的Breg(IL-35+Breg)。他们指出IL-35抑制疾病的发展主要通过调控T细胞介导的免疫应答以及B细胞的抗原提呈能力。之后Wang等[6,9]的实验证实IL-35+Breg可以抑制中枢神经系统的免疫性疾病的发展，并表明IL-35+Breg在自身免疫性疾病宿主免疫发挥了关键的作用。同时他们指出IL-35+Breg的免疫调节作用是其受体IL-12Rβ2、IL-27Rα通过激活STAT3/STAT1信号通路实现的。

CD80与CD86是Breg表面的一对共刺激分子，是Breg与细胞相互接触发挥免疫抑制作用的重要因素。它们通过与靶细胞表面的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA4)或CD28的相互作用，对Treg的活化相当重要。在EAE小鼠模型中，Breg表面表达的CD80与CD86对于聚集FOXP3+Treg细胞进入脊髓细胞发挥免疫抑制作用具有明显的影响[14]。Breg 还可通过CD40、B7-2 通路抑制效应性T 细胞增殖,从而发挥免疫抑制功能。此外，Ray[15]提出肿瘤坏死因子相关受体配体(GITRL)、程序凋亡因子1(PD-1)及其受体PD-1L、FasL等在Breg发挥负向免疫调节作用具有一定的作用。总之，Breg的免疫负调控的作用的发挥是多途径的，但其具体的作用机制还有待进一步的研究[10,16]。

2Breg与自身免疫性疾病

2.1Breg与实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(Exper-imental autoimmune encephalomyelitis， EAE)EAE是一种由T细胞介导的以中心神经系统脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病。EAE小鼠模型主要是模拟人类MS。近年研究发现，B细胞缺失的EAE小鼠的病情恶化更为严重，并且通过将野生型小鼠的B细胞与缺乏分泌IL-10功能的B细胞分别过继转移到B细胞缺失的EAE小鼠体内，发现过继转移野生小鼠的B细胞可以改善病情。此结果证实了IL-10是抑制EAE病情的主要因素。Matsushita[17]的研究发现早期过继转移B10可以直接抑制EAE的病情发展，降低EAE的发病率；然而，晚期过继转移并不会出现抑制的情况。Ray等[18]在EAE小鼠实验中发现B细胞缺失小鼠体内的Treg数量明显减少，表明EAE中的Breg可能通过调节Treg来维持免疫耐受。此外，他们还指出在EAE中Breg发挥免疫抑制功能并不依赖B7的表达以及IL-10的分泌。

2.2Breg与系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)NZB/WF1与MRL.Fas(lpr)是典型的SLE的小鼠模型。研究发现CD19基因敲除的NZB/WF1(CD19-/-NZB/WF1)小鼠的病情较野生型的更为严重，蛋白尿以及肾小管肾炎都有所增加，并且存活率也呈下降趋势[19]。他们在实验中发现经过继转移CD1dhiCD5+B细胞后，CD19-/-NZB/W F1小鼠的存活率明显增加，而且小鼠体内的CD4+CD25+Treg比例明显增加。为此，研究者提出Breg还可以通过诱导Treg的产生抑制SLE的进展。而在SLE的另一个小鼠模型—MRL.Fas(lpr)中，研究者发现B细胞分泌的IL-10并没有抑制反应性B、T细胞活化的功能[20]。2010年Blair等[11]指出：在SLE患者外周血中,CD19+CD24hiCD38hiB细胞的负向免疫调节作用缺失。经过CD40的刺激，CD19+CD24hiCD38hiB细胞可以通过分泌的IL-10抑制Th1的分化。同时，他们也指出在SLE患者中的CD19+CD24hiCD38hiB细胞可能由于STAT3的低磷酸化，从而导致其抑制功能低下。同时，Gao也指出[21]： CD19+FSChiB细胞在SLE患者中的免疫调节功能缺失，而在其他的免疫疾病中还具备一定的调节功能。为此，研究者提出在SLE患者体内诱导Breg的活化机制存在缺陷。

2.3Breg与类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)胶原诱导关节炎(Collagen induced arthritis，CIA)小鼠是类风湿性关节炎的典型小鼠模型，此类小鼠主要是在体内注射了完全弗氏佐剂从而破坏小鼠的软骨及骨骼，导致其爪子的肿胀。早期研究表明在B细胞耗竭前，胶原蛋白诱导的免疫可以延迟疾病的发生、抑制抗体的产生以及显著减低疾病的严重程度；而在B细胞耗竭后，胶原蛋白诱导的免疫对于关节炎的进展与疾病的严重程度并没有明显的影响。Carter等[22]在B10细胞缺失的关节炎小鼠体内发现IL-17以及IFN-γ上升，小鼠的病情进一步恶化。在早期关节炎的小鼠体内过继转移体外诱导激活的CD5+CD1dhiB细胞，小鼠关节炎的严重程度降低，病情发展延迟，并且小鼠体内CD4+T细胞分泌IL-17的量也显著下降[23]。也有研究直接指出由Breg分泌的IL-10在抑制CIA病情的发展中发挥着关键的作用[24]。Cui等[25]发现在RA患者体内CD19+CD5+CD1dhiB细胞比例下降，它与疾病的活动性评分呈负相关，可以影响疾病的活动性。

2.4Breg与炎症性肠炎( Inflammatory bowel disease，IBD)IBD包括克罗恩病(Crohn's disease，CD)、溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)等疾病，主要是由Th2细胞针对共生微生物区系的免疫反应导致的肠道黏膜组织异常。早期有关B细胞的免疫调节功能主要在IBD的小鼠模型上研究的。1997年Mizoguchi等在TCRα-/-小鼠的肠系膜淋巴结中发现了一群可以上调CD1d、分泌IL-10的B细胞，并发现其可以抑制疾病的发展。有研究显示，在葡聚糖硫酸酯钠(Dextran sulfate sodium，DSS)诱导的急性结肠炎小鼠的脾脏内发现了一群B10细胞—CD5+CD1dhi，可以缓解结肠炎的发展[26,27]。Yanaba等[28]将CD5+CD1dhiB细胞过继转移到DSS诱导的结肠炎小鼠体内，发现小鼠通过分泌IL-10预防体重的下降及肠道的出血，病情得到很大程度的改善。2014年Akihiko[29]提出CD患者的B细胞经体外刺激培养，其分泌IL-10的量较正常对照组的少，并指出CD患者体内的Breg细胞存在着功能缺失，但是没有明确指出此功能缺失是否直接导致疾病的发展。

2.5Breg与 I 型糖尿病(Type 1 diabetes ,T1D)非肥胖型糖尿病(Nonobese diabetic，NOD)能自然发展为T细胞介导的免疫反应，破坏胰岛β细胞，最终形成T1D，是研究T1D的主要模型。NOD小鼠主要在13～15周开始发病，将近80%的雌性小鼠以及20%的雄性小鼠在30周时可发展为T1D[23]。早期研究者将激活后的B细胞过继转移到具有前驱糖尿病症状的NOD小鼠体内，可以抑制自发性Th1细胞免疫应答，延迟糖尿病的发病。进一步研究发现激活的B细胞可以维持NOD小鼠体内的免疫耐受，延缓疾病的发展，并指出Breg的免疫调节功能主要作用在疾病的早期。他们在NOD小鼠的4～5周时过继转移活化的B细胞，可以延缓疾病的发生，甚至降低疾病的发病率；而在第9周以后过继转移B细胞则只能延缓疾病的发生[30]。值得注意的是，B细胞分泌的IL-10对于NOD小鼠疾病的发展具有关键的作用。有研究指出：过继转移IL-10基因敲除的B细胞，NOD小鼠的发病率以及胰岛的炎症并没有呈现下降的趋势。同时，Kleffel等[31]研究发现在T1D患者外周血中，IL-10+及CD40+B细胞的比例下降，并且外周血中的B细胞并没有免疫调节的特性[31]。总之，上述的研究都表明Breg可以通过下调Th1细胞的免疫应答或者分泌抑制性细胞因子预防T1D疾病的发生发展。

3结语

Breg作为一群新型具有免疫负调节功能的B细胞亚群，已引起免疫学界广泛关注。尽管近年越来越多的研究集中在Breg上，但有关Breg的诸多问题尚有待进一步的研究: 抗原刺激和BCR信号是小鼠Breg功能形成必不可少的因素，但具体是何种抗原可以促进Breg的发展仍不清楚； 还有，TLRs、CD40、CD80/CD86等都参与Breg的活化,但并不知道是否还有其他重要的共刺激分子或细胞因子参与此过程；再者，IL-10是Breg发挥负向调节功能的关键因素，但对于Breg分泌的IL-10，其具体是如何发挥作用的，是否由特定的转录因子表达，对自身抗原的免疫耐受是暂时的还是长期的等等。随着这些问题的解决，相信Breg细胞将会为临床治疗人类免疫性疾病提供全新的思路与策略。

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[收稿2015-07-13修回2015-10-20]

(编辑张晓舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.034

作者简介：吴华仙(1990年-)，女，在读硕士，主要从事自身免疫病发病机制的研究，E-mail:691273246@qq.com。 通讯作者及指导教师：陈曲波(1964年-)，男，主任技师，主要从事自身免疫性疾病发病机制及其实验室诊断研究，E-mail:qubochen326@126.com。

中图分类号R392

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)07-1077-04

①本文为广东省科技计划项目[2013(137)-165]、广东省自筹经费类科技计划项目[20162C0099]、广东省中医院院内专项[2015KT1468]。