小干扰RNA在体内的递送和其对自身免疫性疾病治疗的研究进展①

李 琼 综述 王永福 审校

(包头医学院第一附属医院风湿免疫科，包头014010)



小干扰RNA在体内的递送和其对自身免疫性疾病治疗的研究进展①

李 琼 综述 王永福 审校

(包头医学院第一附属医院风湿免疫科，包头014010)

RNA干扰(RNA interference,RNAi)发生于大多数真核细胞中负责转录后基因调节，其作用机制是通过导入双链RNA(double strands RNA,dsRNA)有效降解与其互补的信使RNA(messenger RNA，mRNA)导致转录后水平的基因沉默[1]。由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)介导的基因沉默有两方面的应用：①作为一种工具发现、确定疾病发病机制，②作为创新疗法应用于疾病治疗。自身免疫性疾病(Autoimmune diseases,AID)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，主要包括干燥综合征、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化症等。目前RNAi已经用于癌症[2]、HIV[3]、呼吸系统疾病、神经系统疾病和自身免疫性疾病[4]的治疗。但国内对于siRNA在自身免疫性疾病治疗中的研究甚少。

1 RNAi技术

1.1 RNAi在体内的作用 siRNA设计是实现RNA干扰的有效途径，siRNA可以通过机械方式直接递送到细胞质，如基因枪、电穿孔等可将siRNA递送进入细胞[5]，但未受保护的siRNA分子是高度不稳定的，容易在血浆中降解，仅有五分钟的半衰期[6]，而且带负电荷的裸siRNA在体内给药后不能随意穿过细胞膜。由于物理技术使用范围局限，而且还有创伤性。这使其临床应用受到很大限制。因而需要一个递送系统有效保护和运输siRNA至靶细胞细胞质中[7]，对siRNA进行化学修饰或借助非病毒载体和病毒载体进行体内递送可延长siRNA在体内的半衰期，而且不改变基因沉默的效率。

1.2 siRNA在体内的递送 siRNA的递送方法有很多种，国外对此进行了大量的研究，但常见的递送方法有两种：①化学修饰的siRNA直接递送，②借助载体进行递送，载体递送分非病毒载体和病毒载体，而病毒载体又分为腺病毒载体和慢病毒载体。

1.2.1 化学修饰的siRNA直接递送 Soutschek等[8]第一个证明化学修饰的siRNA全身给药后能够沉默内源基因。目前siRNA化学修饰主要包括骨架修饰、糖修饰、核酸碱基修饰、5′或3′末端修饰等。2′-O-甲基修饰siRNA正义链可增强其抗降解的能力，同时提高siRNA稳定性[9]。邓军霞等[10]设计靶向5′UTR的siRNA，通过化学修饰，研究其对乳鼠EV71感染的抑制作用，结果发现：靶向 5′UTR 的化学修饰 siRNAs 降低了感染乳鼠小肠组织中EV71 RNA的转录水平，改善了感染症状，提高了生存率。

1.2.2 非病毒载体递送的方法 常用的非病毒载体包括：脂质体复合物、阳离子聚合物、无机物材料如纳米金、纳米碳管等，以及细胞穿膜肽等[11]。

Zhang等[12]和Li等[13]用碳酸钙制备了脂质体制剂，这种制剂若暴露于酸性环境中，就会导致其肿胀和破裂，从而将siRNA释放入细胞质中。Sato等[14]合成了pH敏感的阳离子脂质(YSK05)递送siRNA，由于YSK05含有N-甲基哌啶环，其在酸性内体中变成质子，使用这种阳离子脂质体递送polo样激酶1(PLK1)siRNA可导致人类肾细胞癌模型靶mRNA和蛋白质减少50%。

由于聚乙烯亚胺(PEI)在体外有着高转染效率，也被用于递送siRNA。研究表明，无论是在体内还是体外，PEG修饰的PEI-siRNA靶向CDv6已被成功地递送至胃癌细胞[15]。survivin基因是细胞凋亡抑制蛋白IAP家族的一员，在肿瘤细胞中高表达，下调survivin基因的表达成为治疗癌症的有效方法。Yang等[16]用TAT肽修饰的壳聚糖载体TAT-G-CS递送特异性靶向survivin基因的siRNA到乳腺癌的小鼠模型，抑制了肿瘤的生长和转移。Han等[17]制备了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽标记的壳聚糖纳米粒子递送PLXDC1 siRNA治疗卵巢癌小鼠，明显抑制了肿瘤的生长。

无机材料中，纳米金(AuNP)是最常用的，因其可制作成不同的尺寸且易于表面修饰等特殊的物理化学性质。Conde等[18]使用靶向肿瘤细胞的RGD/siRNA-AuNPs治疗肺癌小鼠模型，结果显著下调c-myc基因的表达，抑制肿瘤生长，延长了肺癌小鼠存活率。Lu等[19]通过中空的AuNP递送肿瘤特异性核转录因子B(NF-κB)P65 siRNA治疗人HeLa宫颈癌模型。

1.2.3 病毒载体递送的方法 常用的病毒载体有腺病毒(Adenovirus，AAV)、慢病毒(Lentiviral，LV)和逆转录病毒[20]。很多体内研究主要使用腺病毒和慢病毒载体表达短发夹RNA(Short hairpin RNA，shRNAs)来评估RNAi治疗疾病的有效性。AAV和LV载体是具有不同衣壳或被膜蛋白质的假型载体。这两个载体的主要区别是它们以何种程度整合入宿主基因组中，腺病毒载体为病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因，而慢病毒载体为病毒基因组整合于宿主基因组中，长时间、稳定表达外源基因[21]。

首次示范使用RNAi和病毒载体介导的基因转染来治疗动物疾病模型的是Beverly Davidson实验室[22,23]。脊髓小脑性共济失调1型(SCA-1)是共济失调蛋白-1基因多聚谷氨酰胺通道膨胀的神经变性疾病的一种，AAV载体表达靶向人共济失调蛋白-1基因的shRNA，用来治疗SCA-1小鼠，可以恢复SCA-1小鼠的小脑形态，改善运动协调性。毕杨等[24]设计特异性针对大鼠维甲酸受体β(RARβ)基因的siRNA序列，用腺病毒载体将其递送到全反式维甲酸处理的骨髓间充质干细胞中，检测其对RARβ的表达的影响。Xia等[25]构建Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒结合血卟啉衍生物(HPD)，体外研究其对人肺腺癌细胞系A549的作用，MTT、流式细胞术、ELISA和免疫印迹结果均可见：A549细胞的增殖被抑制，细胞凋亡数增加，APE1蛋白质的表达显著降低。

White等[21]用慢病毒将PrpshRNA 递送朊病毒病的小鼠海马体，结果显示海马朊病毒mRNA表达减少80%，而且也减轻了小鼠海绵状变性、延长了生存时间。与癌旁区和人肺成纤维细胞HLF细胞相比，ZEB-1在肺腺癌组织和A549、H1299细胞系中呈高表达水平，Liu等[26]使用慢病毒将ZEB-1 siRNA递送到肺腺癌细胞中，研究ZEB1基因的表达和肺腺癌细胞增殖能力的关系，结果证明ZEB1-siRNA能降低肺腺癌细胞的增殖，进一步研究表明其可以显著降低小鼠肿瘤的生长。Lian等[27]为了探索PTP4A3基因的表达对肺癌细胞生长的作用，用慢病毒递送特异性靶向PTP4A3基因的siRNA到人肺癌H1299细胞，结果细胞中PTP4A3 mRNA和蛋白质水平均下降。

2 RNAi治疗在自身免疫性疾病中的应用

目前，siRNA在自身免疫性疾病的治疗仍停留在实验阶段。自身免疫性疾病是多因素疾病，表现为免疫系统异常和关节受累。siRNA对自身免疫性疾病的治疗效果，取决于靶向疾病的特征，以及是否需要系统或局部地恢复受累关节。

2.1 干燥综合征 干燥综合征(Sjogren′s syndr-ome，SS)是一种主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫病，其特征是淋巴细胞浸润唾液腺和泪腺，造成严重口干和眼干的症状，部分原因是腺体中的腺泡细胞凋亡。目前，干燥综合征患者的治疗主要是使用糖皮质激素和免疫抑制剂。Pauley等[28]将靶向胱天蛋白酶-3基因的siRNA分子连接到碳酰胆碱，通过毒蕈碱受体介导的细胞内吞途径摄取siRNA，实现siRNA的特异性传递，同时，该研究发现siRNA和碳酰胆碱在共轭后保持其各自的功能，胱天蛋白酶-3基因的siRNA分子和碳酰胆碱的结合物转染HSG细胞后胱天蛋白酶-3基因/蛋白的表达显著降低，这表明该结合物通过毒蕈碱受体的内吞作用被细胞摄取。更重要的是，此结合物还可抑制HSG细胞分泌炎性细胞因子。因此，用这一策略来阻止干燥综合征患者腺泡细胞的凋亡，让其保持分泌功能，从而改善病人的生活质量是可行的。很多研究者认为，α-胞衬蛋白与SS的发病相关。刘媛等[29]针对α-胞衬蛋白构建了siRNA真核表达载体，观察其对原发性干燥综合征模型小鼠的治疗效果，结果显示，与对照组和空载体组相比，α-胞衬蛋白 mRNA和蛋白质的表达均明显降低，小鼠血清中IL-17水平显著下降，而且小鼠泪腺和肺脏炎性细胞浸润程度减轻，从而抑制了疾病的进展。

2.2 类风湿性关节炎 类风湿性关节炎(Rheu-matoid arthritis，RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫性疾病，表现为以双手和腕关节等小关节受累为主的对称性、持续性多关节炎。Apparailly等[30]使用RNAi技术沉默目标基因，siRNA特异性靶向促炎因子(TNF,IL-1β,IL-6、 IL-18)、细胞溶质磷脂酶A2α和参与信号通路的激酶(如：NR2C2,也称为TAK1)[31，32]，可使目标基因沉默，关节炎特征减少。已经有siRNA靶向滑膜细胞体外治疗RA的研究。RA关节退化的机制之一是滑膜细胞异常耐凋亡，产生高水平的炎性细胞因子和金属蛋白酶[33]。细胞凋亡的诱导是死亡受体的共同的属性，其中大部分属于肿瘤坏死因子(TNF)家族。然而，某些种类的TRAIL受体，如TRAIL4，具有抗凋亡活性。2007年，Terzioglu等[34]用靶向TRAIL4的siRNA联合促凋亡TRAILS转染试剂可阻止抗滑膜细胞的凋亡。这些受体的表达平衡可能是一个新的基因治疗策略。

有研究阐述了siRNA在治疗RA中的潜在用途。2005年，Schiffelers等[35]使用局部电穿孔法将siRNA递送到关节炎小鼠的关节中。由此表明，靶向TNFα siRNA的治疗抑制了胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)小鼠的关节炎症反应。2006年，Khoury等[36]使用阳离子脂质体通过尾静脉将TNF-α的siRNA注射到胶原诱导性关节炎小鼠体内，结果显示，小鼠TNF-α的表达减少50%～70%，关节炎症状几乎完全消失。

但是这种全身给药的方法使siRNA被脑、肺等多个器官摄取。一个日本研究小组拓展了这项工作，通过wraposome递送TNF-α的siRNA到胶原诱导性关节炎小鼠的关节中[27]，结果显示关节炎的严重程度降低，关节中TNF-α表达下降，而且在发炎的滑膜中，siRNA主要是结合巨噬细胞和嗜中性粒细胞[37,38]。由此说明siRNA可有效抑制炎症分子的表达，进一步达到治疗RA的目的。

Chen等[39]在胶原诱导性关节炎小鼠中使用慢病毒载体递送靶向TLR7的shRNA，结果也显示关节炎症状的严重程度下降，关节中的炎症因子表达水平减少。

通过关节内电转移靶向CD81的siRNA也能改善CIA大鼠，CD81是一种细胞表面分子，能上调RA患者关节滑膜细胞、影响细胞黏附、形态学、活化和增殖[40]。反复敲除关节组织中的CD81能抑制滑膜增生，进而抑制关节软骨的退化和骨侵蚀。虽然这些研究有一定程度的临床疗效，但是反复电转移siRNA到炎症关节需要减少持久的局部或全身炎症反应。

因为关节是在一个封闭的环境中，所以单个受累关节的局部给药，对于修复软骨破坏是有利的。从理论上讲，在受累关节内直接注射siRNA，作用部位能达到高浓度，而且全身低毒性反应。关节内递送口服生物利用度低的RNA-based药物也是特别令人感兴趣的。但是，siRNA注入关节后可被迅速清除。因此，需要研究制备可以在关节腔内持续数周或数月释放适用量siRNA的制剂。有人提出水凝胶或PLGA微球剂型可以控制寡核苷酸实现这样的连续释放[41-46]。

2.3 系统性红斑狼疮 系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)，是自身免疫介导的，以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病。随着人类基因组计划研究的不断进展，系统性红斑狼疮的多个基因易感位点已被发现。多项研究表明定位于16q12的OAZ(Olf1 /EBF associated zinc finger protein)基因与SLE疾病活性和特异性自身抗体相关，SLE患者外周血Olf1 /EBF相关锌指蛋白(OAZ)信号通路的基因呈高表达并伴有自身抗体产生。2010年，Feng等[47]研究发现在抗DS-DNA、抗SM抗体阳性的患者中，OAZ的表达显著升高，将OAZ与特异性siRNA共培养3 d后，使用qPCR测定OAZ mRNA水平，和对照组相比减少(74.6 ± 6.4)%，而且与SLE活动性相关的因子总IgG，抗核抗体(ANA)、IFN-γ、IL-10、IL-12和IL-21均有所降低。有研究报道了siRNA阻断分化抑制因子3(ID3)对SLE患者抗核抗体产生的影响，结果证明，ID3-siRNA可影响SLE患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中相关基因的表达，ID3沉默效率达80%，ANA、IL-6浓度显著低于对照组。同年，Zhou等[48]构建了编码B细胞诱导成熟蛋白l Blimp-1-siRNA的腺病毒，并注射到BWF1狼疮鼠。结果表明，施用Ad-siRNA/Blimp-1显著降低了基因Blimp-1的表达，抑制了B细胞在体内分化成浆细胞，阻止了anti-dsDNA抗体的产生，减轻了狼疮小鼠的症状，延长了狼疮小鼠的寿命。

2.4 系统性硬化症 系统性硬化症(systemic sclerosis，SSc)是一种以皮肤变硬和增厚为主要特征的结缔组织病。研究表明，TGF-β1是用于治疗和预防系统性硬化症的潜在靶点。因为该细胞因子在多种疾病纤维化的病理生理中起重要作用，靶向此分子的RNAi可能阻止纤维化发展，改善已有的症状。 Ishibuchi等[49]评估了靶向结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor，CTGF)的siRNA对健康和SSc患者细胞外基质代谢的影响，结果证实，CTGF特异性siRNA降低了人类成纤维细胞中CTGF、Ⅰ型胶原的水平，增加了MMP-1的水平，但CTGF-siRNA 降低了健康者MMP-1的水平，而且持续抑制了成纤维细胞的增殖，改善了SSc患者的生活质量。2013年，Liu等[50]体外培养取自皮损硬皮病人和健康成人的成纤维细胞，通过免疫细胞化学测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达，两组成纤维细胞均用PDGF-AA、TGF-β1以及PDGF-AA和TGF-β1共刺激，然后分别用RT-PCR和Western blot 检测PDGFR-α和α-SMA mRNA以及蛋白质的表达，结果显示，相比于对照组，三组刺激均显著上调SSc患者成纤维细胞中PDGFR-α和α-SMA mRNA以及蛋白质的表达，用靶向PDGFR-α的siRNA处理后，PDGFR-α的表达水平降低，且阻止了成纤维细胞横向分化成肌成纤维细胞。

3 总结

经FDA认证的DMAPAP制剂能靶向递送siRNA到炎症部位的单核细胞中，这种策略是目前临床上最有应用前景的。事实上，这种载体全身给药治疗炎症效果是最佳的，因为它使循环单核细胞内的促炎基因沉默，并且可以永久的渗入炎症组织，从而治疗全身每一个发炎的关节。虽然RNAi疗法有显著进步，但仍需要大量的研究来完善体内siRNA的设计和递送。随着时间的推移，RNAi疗法将被证明是下一个治疗自身免疫性疾病的“Superdrug”。

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[收稿2015-04-25 修回2015-05-15]

(编辑 许四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.033

①本文为国家自然科学基金(81360463)，内蒙古自治区科技计划项目(20120403)和包头市医药卫生基金项目(2009S1001-34)。

李 琼(1988年-),女,在读硕士,主要从事干燥综合征的发病机制、临床表现及其基因治疗的研究,E-mail：793314420@qq.com。

及指导教师：王永福(1968年-)，男，博士，主任医师，教授，主要从事风湿免疫疾病发病机制及临床诊治方法的研究，E-mail：wyf5168@hotmail.com。

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1000-484X(2016)04-0595-05