肝癌干细胞自我更新信号转导及作为潜在治疗靶点的研究进展

许赫雷，吴纯启，董延生，李 曼，谢丽华，王全军，王茜莎

（1.广东药科大学药科学院，广东 广州 510006；2.军事医学科学院毒物药物研究所，国家北京药物安全评价研究中心，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

·综 述·

肝癌干细胞自我更新信号转导及作为潜在治疗靶点的研究进展

许赫雷1，吴纯启2，董延生2，李 曼1，谢丽华1，王全军2，王茜莎1

（1.广东药科大学药科学院，广东 广州 510006；2.军事医学科学院毒物药物研究所，国家北京药物安全评价研究中心，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

肝细胞癌复发率高、易转移和化疗耐药等严重影响患者生存率。临床研究发现，这很大程度上归咎于肝癌干细胞（CSC）或肿瘤起始细胞的存在或残留。本文将重点围绕肝CSC特点，主要临床表征，自我更新信号通路Wnt/β联蛋白、信号转导和转录激活物3、NANOG、膜联蛋白A3/Jun激酶和四跨膜蛋白L6家族成员5/CD44讨论，并针对信号通路中潜在靶点的药物治疗进行分析，以期为寻找选择性靶向肝CSC自我更新信号的药物提供依据。

肝细胞癌；肝肿瘤；干细胞；信号转导

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在国内的致死性恶性肿瘤中已居第4位，在2015年大约新增466 100例，死亡约422 100例［1］，HCC表现的主要组织学表型在原发性肝癌中占70%～85%，5年生存率普遍较低［2］。在传统肝癌治疗过程中，高复发率以及抗癌药物的毒副作用使长期治疗或预后变得更加不稳定，而肝癌细胞的耐药，复发和转移很大程度上归咎于肿瘤起始细胞（tumorinitiating cells，TIC）或肝癌干细胞（cancer stem cells，CSC），即分化于正常肝干细胞和HCC细胞中具有自我更新的、高致瘤和药物耐药细胞亚群的存在或残留［3］。研究发现，肝CSC的自我更新机制可能在调控肿瘤细胞的增殖、复发、转移和耐药中发挥关键作用。自我更新是指一个细胞分裂为两个细胞，其中一个子代细胞仍然保持与亲代细胞完全相同的未分化状态，而另一个子代细胞则定向分化，而肿瘤干细胞的自我更新是指肿瘤干细胞通过非对称分裂形成一个与母代肿瘤干细胞完全一样的肿瘤干细胞的过程，因此，CSC与胚胎和成年干细胞一样，可基于OCT4，NANOG和Klf-4等转录因子［4］在肿瘤内分化成其他类型细胞。最近大量的实验数据显示，Wnt/β联蛋白、信号传导和转录激活物3（signal transducers and activators of transcrip⁃tion 3，STAT3）、NANOG、膜联蛋白A3/c-JunN端激酶（annexinA3/c-JunN-terminalkinase，ANXA3/ JNK）、四跨膜蛋白L6家族成员5（chapter four transmembrane 4 L six family member 5，TM4SF5）/ CD44、Sonic Hedgehog、转化生长因子β（trans⁃forming growth factors-β，TGF-β）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称作Akt）等信号通路以及标志物CD24，CD44，CD90和CD133等对维持和调控肝CSC自我更新紧密相关［5-6］。如果能阐明肝CSC分子机制则为抑制肝CSC维持自身更新提供了可能，本文将侧重信号转导通路和主要靶标药物治疗进行综述。

1 肝癌干细胞研究现状

1.1 肝癌干细胞

自第一次在髓样白血病中发现TIC以后，在慢性肝疾病的组织病理和大量的实验数据表明肝癌中存在CSC［7］，而DNA甲基化和微环境改变等在肿瘤转移过程中也可形成CSC［8］。肝CSC作为癌细胞的一个较小亚群且有高致瘤能力，而与正常组织干细胞一样具有相似的自我更新和分化信号转导通路。异质性和高复发率是HCC的2个主要特点［3］。研究发现，异质性是肿瘤细胞内分层组织中具有干/祖始细胞特点的细胞亚群即肿瘤干细胞作用的结果［9］。和正常组织肝细胞一样，肝CSC可能来自成熟干细胞和祖始细胞的分化，致癌基因同样具有相似的基因调控和发育途径，包括自我更新，无限增殖和形成新个体的多能性能力［7］。肝CSC具有自我更新和分层组织的特点在异种移植动物模型的新鲜HCC样品中得到大量实验证实［10］。同时，CSC来源于正常干细胞的突变或重编程以及微环境的诱导，而肿瘤自身的生存不仅需要营养供给，还需要干细胞的分化补充。因此，肿瘤内CSC会不断补充损伤或凋亡的癌细胞，给肿瘤的复发和转移带来极大隐患。大量研究证实，CSC对HCC的复发和转移起着至关重要作用［11］。

1.2 肝癌干细胞的临床表征

肿瘤的异质性以及微环境的改变使CSC包含多个表面抗原标志物，如CD24、CD44、CD90、CD133、细胞间黏附分子1和上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）等。肝CSC在临床试验研究中一般采用荧光激活细胞分选系统法和磁化细胞分离法，利用癌细胞膜表面这些抗原标志物与特异荧光抗体结合或自身干细胞特有功能分离与鉴别。Ma等［12］从HCC患者组织样本、其血液循环的细胞和HCC细胞中用膜表面抗原均可分离获得肝CSC。大量的实验证实，其中CD133和CD90为富集肝CSC标志物，而CD133+和CD90+肝CSC与肿瘤免疫逃逸、肿瘤信号转导、化疗耐药和放疗耐受紧密相关。

CD133（AC133）作为CSC表面标志物在很多实体瘤中均有发现，包括HCC。利用免疫组织化学法和酶联免疫吸附实验，在HCC患者血液和新鲜肿瘤组织中鉴定出较小CD133细胞亚群［13］。在软琼脂集落形成实验中，这一亚群细胞显示较强的侵袭力，并在免疫缺陷裸鼠实验中，CD133+细胞比CD133－细胞显示高的克隆形成能力、高增殖率和高致瘤潜力，且与临床病理进程的表达相一致。CD133水平的增高也预示着预后高复发率以及较短的生存预期。因此，靶向CD133蕴含着巨大的临床价值。

胸腺细胞抗原CD90常作为干细胞的标志物。研究表明，CD90+也作为肝CSC的更特殊表面标志物［13］。之前研究CD90在肿瘤中表达，然而在正常组织中未显现［12］。最近研究发现，在31例患者肝癌组织中，CD90的表达不仅与早期复发转移相关［14］，且CD90高表达水平与不良预后密切相关［15］，在基因表达和mRNA分析中，与其阴性细胞相比，有明显凋亡与抗凋亡基因的失衡［16］。另外，CD90+肝CSC在异种成瘤实验中显示高致瘤能力，且促使CSC相关干性基因的表达，如Nanog，Oct4和Sox2［15］。研究证实，CD90在肿瘤生长中可增加侵袭表型，与HCC的低分化、复发和不良预后相一致。

在肝CSC研究中，肿瘤生存微环境不断改变，肝CSC膜抗原表型发生部分变化，若要更精确地鉴别和诊断肝CSC较小群体，需联合其他标志物共同标记肝CSC，如CD133/CD24，CD133/CD44和CD133/CD90等以及对异种移植模型样本表型评价，以便进一步阐明肝CSC的自我更新分子机制，进而有效筛选抗肿瘤药物，寻找降低或根除肝CSC的方法。

2 肝癌干细胞自我更新调控路径

肝癌的复发和转移与CSC通过维持自身功能的自我更新信号密切相关，理解肝CSC维持自我更新的信号传导通路，对寻找潜在靶标和治疗方法极其重要，目前信号转导通路主要有Wnt/β联蛋白、STAT3，NANOG，ANXA3/JNK和TM4SF5/CD44等。

2.1 Wnt/ β联蛋白

Wnt信号在干细胞生物学中对维持自身平衡、组织和器官的修复和再生发挥着重要作用。经典的Wnt/β联蛋白信号通路在肝CSC的自我更新，分化和化疗耐药中发挥着重要作用［17］。Wnt信号的异常与肝癌和其他慢性肝病的发生息息相关［18-19］。HCC中Wnt信号激活造成β联蛋白的异常激活，Wnt受体的过表达，β联蛋白的激活则加速HCC的恶化［20］。同时，Wnt/β联蛋白信号通路的失调导致其下游Notch上调，进而促进肝CSC肿瘤球的形成和恶化［21］。Wnt/β联蛋白在50%HCC的临床病例中有活化趋势［21］，并与EpCAM表达水平相一致。因此，Wnt/β联蛋白信号可作为治疗肝CSC自我更新和肿瘤恶化的重要潜在分子靶点［23］。

在HCC中分离的CSC如CD133+，EpCAM+和CD24+中均检到Wnt/β联蛋白得到优先激活，而Wnt/β联蛋白的缺失则降低肝CSC的自我更新和致瘤能力［24］。T细胞因子转录因子7（transcrip⁃tion factor-7，TCF-7）具有IncTCF7（IncRNA）基于Wnt信号的调节通路，通过募集SW/SNF复合体的激活高表达TCF-7，从而促进肝CSC中的致癌基因活化，进而进行自我更新和增殖。提示TCF-7调节的Wnt信号对肝CSC自我更新和致瘤性有重要作用，当TCF-7缺失时则Wnt下游靶基因会损伤CSC［25］。Kim等［26］也发现，肝CSC与Wnt/β联蛋白信号的激活高度相关，而这种活化与CD133的表达和乙醛脱氢酶致活相一致，但小分子抑制剂CWP232228能有效抑制核内β联蛋白与TCF结合进而抑制Wnt/β联蛋白信号，降低CD133+/ALDH+肝CSC特点。在人和啮齿类HCC中，癌胚蛋白RNA结合蛋白片段Y染色体，即Y染色体上RNA结合基元（RNA-binding motif on Y chromosome，RBMY）在降低糖原合酶激酶3β活性时，会导致Wnt/β联蛋白信号的异常激活，而RBMY可通过GSK3β的Ser9磷酸化灭活Wnt/β联蛋白，从而控制β联蛋白对CSC自我更新等特性的促进作用［27］。提示Wnt/β联蛋白信号可能成为靶向治疗肝癌的重要靶点。

2.2 信号传导和转录激活物3

STAT3蛋白通过生长因子和细胞因子受体的激活与肿瘤的触发和增殖密切相关，如HCC的形成、生存、血管形成和增殖等［28］。在HCC中STAT3信号通过微RNA（microRNA-21，MR-21）和多靶点调控癌细胞生长、自我更新、血管生成、免疫抑制和化疗耐药，还促进癌扩散转移［29-30］。在HCC中50% STAT3被异常激活［31］，而STAT3异常激活也与临床HCC患者不良预后密切相关。之前研究显示，STAT3会依赖荧光素酶的激活，并伴随STAT3信号下游基因如Bcl-3，Mcl1，c-myc转录水平的上调。激活的STAT3移入细胞核会与CD133启动子结合导致组蛋白乙酰化和CD133的转录［32］。也有报道在人HCC组织中，随着STAT磷酸化的高表达，可促进CD133的转录激活［13］，并在CD133PosHCC中被检测到［33］。

另外，白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）/ STAT3和IL-6/Jak信号的激活对维持干细胞生存、自我更新和上皮间充质转化（epithelial-to-mesen⁃chymal transition，EMT）非常重要［34-35］。在HCC中，IL-6会通过IL-6受体和Janus激酶（JAK）信号激活STAT3而发挥多种功能，显示与STAT3的705位酪氨酸和727位丝氨酸的磷酸化的高表达密切相关［36］，而IL-6抑制剂［37］和两个磷酸化位点的有效抑制［33］均能降低肝CSC的自我更新，有可能作为新的肝癌治疗靶点。

CD24+肝CSC显示，STAT3信号能有效促进HCC的EMT［38］。在临床样品中，富含TIC细胞群能通过qPCR和苏木精-伊红染色显示CD24明显上调，而作为HCC细胞功能性标志的黏蛋白样表面糖蛋白CD24+通过驱动STAT3调节NANOG的高表达实现肿瘤自我更新、分化、侵袭和转移，对患者临床诊断结果和靶向治疗有重要影响［38］。因此，靶向IL-6受体和STAT3信号可能为HCC临床治疗提供新的策略。

2.3 NANOG

NANOG作为不依赖LIF-STAT3途径维持多能干细胞多向分化潜能的重要因子，其激活物在不同CSC呈过表达，不仅作为CSC生物标志物，并且通过胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）信号通路在维持肝CSC的自我更新中起关键作用。研究发现NANOG与愈后休戚相关［39］。之前有报道，从NANOG阳性细胞（NanogPos）的一个小的亚群中发现NANOG表达水平与HCC的临床恶化程度相一致，这不仅是鉴定CSC的一个重要标志物，而且具有自我更新、致瘤、浸润和转移的能力以及化疗耐药的特点，如对索菲替尼和顺铂［40］。在NanogPos模型中，组蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）的敲除能急剧降低肿瘤的发生和抑制肝CSC的增殖和自我更新，相反则通过组蛋白乙酰化参与肝CSC的自我更新，而临床HCC样本中HDAC3的过表达则与病理进程和早期手术切除后复发概率相一致［41］，因此HDAC3有望成为调控肝CSC新的潜在靶点。

在研究肝的TIC、动物模型和临床病例中发现，肿瘤抑制基因NUMB与p53的结合可作为屏障阻挡CSC特性的失衡，因此在维持干细胞自我更新中发挥着关键作用。然而NUMB的磷酸化通常作为调控癌细胞侵袭和转移的标志物［42］，因此在不同种属肝CSC样本中，NANOG通过不典型蛋白激酶C1（aPKCζ）介导NUMB的磷酸化打乱NUMB-p53结合域的平衡或使p53蛋白水解，进而促进TIC的自我更新［43］。NANOG依赖的IGF2BP3和YAP1的下调可阻断TGF-β抑癌基因的相关通路，促进TIC的自我更新和增殖。另一条则逃离保护蛋白NUMB和TBC1D15的相互作用使NANOG调节p53下调，促进TIC的自我更新和增殖［44］。上述提示可靶向NUMB磷酸化间接抑制NANOG通路。

最近研究发现，在HBV感染的HCC中，ATOH8（atonal homolog 8）可与E-盒元件（CANNTG）内的Nanog和Oct4基因物理性结合从而表达维持ESC多能性和自我更新的转录因子［45］。值得注意的是，ATOH8的抑制或缺失可诱导非CSC重编程为CSC，也可诱导CD133-细胞为具有CSC自我更新等特点的CD133+细胞［46］。因此，NANOG通路中调控点的发现为新的靶向治疗方法提供依据。

2.4 膜联蛋白A3/JNK

ANXA3的异常表达在多种肿瘤耐药、EMT和转移中发挥重要作用［47］。研究发现，ANXA3在肝CSC/CIC HCC有过表达趋势，并有富集肝CD133+细胞特点，且与HCC临床分期相一致［48］。患者血清中ANXA3有明显上调趋势，潜在增强CSC的自我更新、致瘤、淋巴转移和耐药能力，在异种移植模型中也得到证实。JNK通路能调控卵巢CSC的自我更新能力，最近也发现ANXA3/JNK有调控肝CSC的自我更新，在CD133+肝CSC中，ANXA3能激活JNK通路，同样增加ANXA3蛋白含量也可激活JNK通路，最终JNK活化能激活肝CSC的自我更新［49］。JNK通路的阻断则降低ANXA3表达，且在ANXA3缺失时，JNK下游靶蛋白激活蛋白1活性则显著降低，提示二者存在正反馈环路系统［50］。因此靶向调节ANXA3/JNK通路任意环节为抑制CD133+肝CSC亚群发挥关键作用。

2.5 TM4SF5/CD44

TM4SF5受体在HCC患者病理检测中呈高表达，可增强癌细胞迁移、转移和球形成能力，并与CD44相互作用调节自我更新，说明与CD133+，CD24-和ALDH的激活相关［46］。与正常肝组织相比，TM4SF5在HCC中呈高表达，明显促进肿瘤的侵袭、转移、黏附和复发［51］。同样，CD44在预后不良HCC中过表达［52］，若CD44与TM4SF5N-糖基化的胞外域结合，导致EMT，细胞异常多层生长和化疗耐药等［53］，TM4SF5/CD44对自我更新非常必要，如球形生长和癌细胞分化等，从而促进肿瘤的起始和血液中循环，同时，二者结合可通过原癌基因蛋白酪氨酸激酶Src（c-Src）、STAT3、转录因子Twist、Bmi1通路调节HCC即TM4SF5/CD44/ c-Src/STAT3/Twist1/Bmi1途径实现自我更新［54］，因此，靶向TM4SF5或TM4SF5与CD44结合、表达和激活的任一环节都可抑制TM4SF5/CD44介导的自我更新或TIC的起始或血液中循环转移。此外，抗TM4SF5多克隆抗体在体内外实验中均能抑制HCC的侵袭和转移，提示TM4SF5可能成为潜在的治疗靶点［55］。

3 肝癌干细胞作为潜在治疗靶点

多激酶抑制剂索拉非尼（sorafenib）是第一个获得美国FDA批准和用于治疗晚期或无法手术HCC仅有的一线靶向药物。HCC尽管可进行如切除、肝移植和消融等有效的治疗，但预后面临着复发和转移的巨大风险，此时的治疗效果微乎其微，因此靶向CSC显得迫切，目前许多研究找到靶向肝CSC自我更新通路的治疗方法。

在信号传导方面，有研究发现蔓荆子黄素能通过下调β-联蛋白阻断Wnt/β联蛋白信号通路而抑制CSC的自我更新能力，第一次证明蔓荆子黄素有根除CSC能力，因此Wnt/β联蛋白有可能成为蔓荆子黄素治疗HCC的潜在靶标［56］。最近发现，利用STAT3的磷酸化诱导肝CSC自我更新的特点，N-磺酰基-氨基联苯可靶向STAT3和血管生成，不仅抑制STAT3磷酸化水平，还抑制微管蛋白的聚合［57］。同时，大量实验数据证明，抑制STAT3的磷酸化能抑制肿瘤的生长，并增加化疗药物对HCC的敏感性［58］。在筛选药物时发现，用于杜尔雷斯综合征和精神分裂失常的药物匹莫齐特（哌咪清，pimo⁃zide）能抑制STAT3依赖荧光素酶或IL-6诱导磷酸化的激活，为老药新用进一步提供佐证，同时发现在HCC中还能逆转因IL-6增加导致STAT3激活引起的CSC自我更新和转移［34］。

对于NAONG的高表达，鬼臼苦素（picropodo⁃phyllin，PPP）和AEW541能有效抑制IGF-1刺激引起IGF-1R的表达，而NANOG可调节IGF-1R，而被PPP抑制的IGF-1R也能调节NANOG，同时IGF-1R调节信号通路的抑制能显著的抑制NAONG的表达和自我更新，提示出一种新的靶向HCC的CSC治疗方法［45］。HDAC3通过组蛋白乙酰化参与肝CSC的自我更新，而HDAC抑制剂能抑制NanogPos中肝CSC的增殖和自我更新呈剂量和时间依赖性，还可增加肝CSC对索拉非尼的敏感性［51］，同样，ATOH8可显著减少CD133细胞数量，抑制非CSC向CSC的转化，也可与5-氟尿嘧啶、顺铂（顺氯氨铂）或联合应用以增加HCC细胞的敏感性，也为临床治疗HCC提供一个新的化疗方案。

在其他方面，抗ANXA3的单抗不仅在体内和HCC异种移植模型中能显著抑制肿瘤的生长和CSC的自我更新，而且肝CSC的体积也随CD133，CD24和EpCAM的下调而衰缩，并导致JNK通路的抑制，同时与顺铂联合应用对HCC抑制将发挥协同作用［50］。而C8orf4基因在肝CSC中弱表达，NOTCH2信号却在肝CSC中被高度致活，NOTCH2的活化水平与HCC患者的临床病理分期以及预后相一致。然而C8orf4可通过对NOTCH2的抑制实现肝CSC自我更新的负向调节［59］。对C8orf4和NOTCH2信号检测可提高临床早期发现和HCC患者预后的监测。因此，ANXA3可作为HCC诊断的一个新的生物标志物，与此同时，它也将作为比较有潜力的治疗靶点，通过抑制癌细胞分化所供应细胞亚群CSC的补给，以及与化疗药物的联合应用为根除肿瘤细胞内细胞亚群提供了可能。

4 展望

HCC早期切除和肝移植预后的复发、转移和化疗耐药，包括晚期肝癌缺乏有效治疗仍然是临床的一大难题，而这很大程度归咎于肝CSC的存在，因此阐明肝CSC维持自我更新的信号传导通路对掌握其生物特性非常重要。根据大量研究资料共同表明，靶向恶性肿瘤的CSC将是非常有发展潜力的治疗策略，把靶标转向具有干细胞自我更新特性的癌细胞亚群，将为肝癌及其他肿瘤的成功治疗提供有力指向［60］。

目前不断发现的肝CSC自我更新的信号转导通路，如Wnt/β联蛋白，STAT3，NANOG，Sonic Hedgehog，TGF-β，AKT和NOTCH等，虽筛选到了针对肝CSC的分子靶标，但面对HCC浩瀚的分子生物学特性以及与整个机体调节系统的盘根错节，显然目前对HCC中CSC的研究只不过是冰山一角。因此，更好地发现调控肝CSC自我更新的关键部分和分子机制对控制或根除癌症将是革命性的进步。同时，需要对目前关于肝CSC自我更新分子机制的研究成果进行整合，如STAT3的激活会通过上调NANOG表达增强CD24+肝CSC的自我更新［38］，并探索建立集各条自我更新通路相互交织中的成熟的数学模型，以期筛选出具有对肝CSC敏感和耐受性好的潜在靶向药物。

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Progress in self-renewal signal pathways of liver cancer stem cells and potential targets for therapy

XU He-lei1，WU Chun-qi2，DONG Yan-sheng2，LI Man1，XIE Li-hua1，WANG Quan-jun2，WANG Xi-sha1
（1.School of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，National Beijing Center for Drug Safety Evaluation and Research，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

There is emerging evidence from clinical studies that the existence of liver cancer stem cells（CSCs）or tumor initiating cells is responsible for the high recurrence rates of tumor，generation of metastasis，and resistance to therapeutic regimens after therapy.Here，the characteristics of liver CSCs，clinical manifestation，molecular signaling Wnt/β-catenin，signal transducers and activators of transcription 3，NANOG，annexin A3/c-Jun N-terminal kinase，and chapter four-transmembrane 4 L six family member 5/CD44in liver CSC self-renewal were briefly reviewed.In addition，potential targets for drug therapy were analyzed，providing some reference for drug discovery that selectively target liver CSC self-renewal signals.

hepatocellular carcinoma；liver neoplasms；stem cells；signal transduction

s：WANG Quan-jun，Tel：（010）66931631，E-mail：wangquanjunbeijing@163.com；WANG Xi-sha，Tel：（010）66931631，E-mail：serann1122@gmail.com

R963

A

1000-3002-（2016）09-0967-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.010

Foundation item：The project supported by National Science and Technology Major Project of China（2013ZX09302303）；National Science and Technology Major Project of China（2012ZX09301-001-008）；and Programs of Beijing Municipal Science＆Technology Commission（Z131100006513010）

2016-03-30 接受日期：2016-08-16）

（本文编辑：乔 虹）

国家科技重大专项（2013ZX09302303）；国家科技重大专项（2012ZX09301-001-008）；北京市科委基金项目（Z131100006513010）

许赫雷，男，硕士研究生，主要从事药物毒理学研究。

王全军，E-mail：wangquanjunbeijing@163.com，Tel：（010）66931631；王茜莎，E-mail：serann1122@gmail.com，Tel：（010）66931631