GADD45 α在遗传毒性检测中的分子原理及研究进展

靳 溪，席 超，刘 恺，刘 进

（北京师范大学生命科学学院实验技术中心，北京 100875）

GADD45 α在遗传毒性检测中的分子原理及研究进展

靳 溪，席 超，刘 恺，刘 进

（北京师范大学生命科学学院实验技术中心，北京 100875）

GADD45α作为细胞生长阻滞和DNA损伤诱导基因家族成员，参与细胞周期阻滞、细胞凋亡和细胞衰老等调控，在多种因素诱导的细胞应激及DNA损伤应答调控网络中发挥重要生物学功能。多种转录因子和蛋白参与GADD45α基因的转录调控。GADD45α蛋白通过与其他蛋白相互作用在基因组稳定性相关的细胞应答调控中发挥作用。基于GADD45α的细胞调控特性构建的遗传毒性检测系统被应用于外源化合物的体外遗传毒性评价，为遗传毒性评价研究提供了新的思路。本文就GADD45α在遗传毒性检测应用中的分子原理和研究进展进行综述。

GADD45α；DNA损伤；细胞周期；遗传毒性检测

生长阻滞和DNA损伤诱导基因（growth arrest and DNA damage-inducible 45α，GADD45α）又名DNA损伤诱导转录基因1（DNA damage-inducible transcript 1）。多种细胞应激因素，包括遗传毒性化合物、细胞营养缺乏、电离辐射和紫外线辐射等都能诱导GADD45α的转录表达，该基因过度表达会导致细胞出现生长阻滞和凋亡现象。该基因编码的蛋白是一类调控分子，其主要功能是保护细胞，在细胞周期阻滞、细胞增殖、细胞凋亡和细胞衰老等调控进程中发挥重要作用［1-6］。基于GADD45α的细胞调控特性构建的遗传毒性检测系统已被应用于外源化合物的遗传毒性检测。该检测方法实现了基于人源细胞的体外遗传毒性评价，具有高特异性、可操作性和良好重复性的优势，同时可满足高通量检测的需求，为毒理学评价方法提供有益的研究参考。

1 GADD45 α遗传毒性检测系统分子原理

基于GADD45α的分子调控机制构建的遗传毒性检测系统主要包括报告质粒和转染细胞2部分，其核心是由该基因启动子、外显子和内含子序列，结合报告荧光基因序列〔绿色荧光蛋白（green fluo⁃rescent protein，GFP）或荧光素酶〕及调控元件构建的报告质粒（图1）。将该质粒转染人淋巴母细胞TK6形成GADD45α遗传毒性检测系统，即可应用于外源化合物的遗传毒性评价。该基因在多种DNA损伤诱导因素下通过不同的调控途径激活转录。若外源化合物具有诱导DNA损伤的效应，则报告质粒中该基因启动子激活，继而发出报告荧光，综合统计分析细胞中荧光强度差异和变化可判断外源化合物诱导该基因转录激活效应，由此实现对外源化合物的遗传毒性评价［7-8］。

图1报告质粒结构示意图.Ⅰ：叉头盒O类转录因子3a结合位点；Ⅱ：Wilms肿瘤基因1-早期生长应答因子1结合位点；Ⅲ：八聚体结合转录因子1和CCAAT结合位点；GFP：绿色荧光蛋白.

1.1 GADD45α基因

人GADD45α基因位于染色体1p3112，全长3278 bp，有4个外显子，mRNA全长1398 bp（NM_001924），编码序列全长498 bp［9］。它主要表达在细胞核内，并广泛表达于多种正常组织中。该基因在物种之间高度保守，在人类、罗猴、家猫、仓鼠、小鼠和大鼠有＞90%的氨基酸序列具有一致性［10-11］。在多种小鼠细胞系、人成纤维细胞、人淋巴细胞和人多种肿瘤细胞中，已证明特定的DNA损伤试剂诱导GADD45α基因表达上调。该基因参与多种因素诱导的细胞DNA损伤和细胞凋亡，以及细胞周期和DNA修复等调控，具有重要的生物学功能［12-17］。

1.2 GADD45α基因的转录调控

多种转录因子和蛋白参与该基因的转录调控。根据外源刺激、细胞类型和生长环境等条件不同，该基因表达调控途径也不同。

1.2.1 P53蛋白与GADD45α转录调控

P53介导的GADD45α上调是水飞蓟宾在紫外线辐射诱导细胞损伤时发挥保护作用的主要调节机制［18］。该基因的第三内含子中有一个高度保守的P53结合位点，结合此位点可促进该基因的转录表达。另外，P53与其他蛋白相互作用间接调控其转录。Wilms肿瘤基因1（Wilms tumor 1，WT1）是一个重要的肿瘤抑制蛋白，核转录因子GADD45α启动子区有WT1结合位点，P53可通过依赖和非依赖途径调控其转录表达［19］。各种影响P53与WT1结合的因素或影响其功能的因素均可能导致GADD45α转录活性的改变。

1.2.2 乳腺癌1号基因蛋白（breast cancer 1，BRCA1）与GADD45α转录调控

研究发现，随着BRCA1的诱导表达，GADD45α的mRNA水平显著升高。多种人细胞系瞬时转染表达BRCA1质粒也能诱导GADD45α基因表达［20］。在DNA损伤因素作用下，八聚体结合转录因子 1（octamer binding transcription factor 1，OCT1）和核转录因子Y亚基α（nuclear transcrip⁃tion factor Y subunit alpha，NF-YA）表达增高，提示这2个转录因子可能参与了遗传毒性的细胞应答。在GADD45α基因启动子-121~-75 bp区间有OCT1结合位点和CCAAT框，可分别与转录因子OCT1和NF-YA结合。凝胶迁移实验进一步证实它们可与GADD45α基因启动子结合［21-24］。BRCA1对GADD45α的转录调控主要是通过与转录因子OCT1和NF-YA相互作用，进而结合于GADD45α基因启动子区OCT1结合位点和CCAAT框，调节GADD45α的基因转录。GADD45α基因启动子区段OCT1结合位点和CCAAT框的碱基序列突变或缺失会导致BRCA1诱导GADD45α基因转录表达的作用下降［22］。Aurora激酶抑制剂通过招募OCT1转录因子至基因启动子关键区域调控GADD45α转录表达［25］。通过OCT-1和NF-YA激活GADD45α转录是紫外线辐射、甲磺酸甲酯和曲古菌素A等刺激因素重要的细胞应答调控方式［21，24］。

1.2.3 其他蛋白与GADD45α转录调控

CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT enhancer binding protein,C/EBP）可诱导GADD45α基因表达［26］。亚砷酸盐和亮氨酸缺乏、蛋白酶体抑制及内质网应激等因素诱导活化转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）激活该基因转录［27］。在磷酸肌醇3抑制剂或氧化应激刺激下，叉头盒O类转录因子3a（forkhead box O 3a，FOXO3a）蛋白结合到该基因启动子激活GADD45α基因转录［28-29］。小鼠成纤维细胞中Myc显著并有选择性地抑制FOXO介导的GADD45α基因表达，Myc和Akt通过失活FOXO抑制该基因转录［30］。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated pro⁃tein kinases，MAPK）信号通路诱导GADD45α表达是通过P38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-ter⁃minal kinase,JNK）活化c-Jun。与P53类似，c-Jun在GADD45α第三内含子区域存在结合位点，激活GADD45α基因的转录。雌激素受体β以不依赖配体的方式与该基因启动子结合募集c-Jun，激活该基因转录，参与调控细胞周期G2/M期阻滞［31］。GADD45α在DNA损伤诱导的细胞衰老调控中发挥重要作用。它通过P38信号通路调控反式激活P53以维持细胞衰老表型。GADD45α，P38和P53之间的反馈调节在成纤维细胞、角质细胞等类型细胞DNA损伤后诱导和维持细胞衰老表型的调控中必不可少［26，32］。

1.3 GADD45α参与DNA修复调控

GADD45α主要通过促进蛋白质之间相互作用或改变蛋白质结构来发挥其生物学功能。各种因素诱导细胞应激或DNA损伤后，它通过参与细胞周期、细胞凋亡和DNA修复等功能的调控以维持细胞基因组稳定性。已有很多文献报道，GADD45α参与细胞周期G1/S期和G2/M期阻滞、细胞凋亡和中心体稳定性的调控机制［3，33-38］。各种因素诱导基因组DNA出现损伤后，DNA会通过多种途径调节进行损伤修复，以保证基因组稳定性，防止恶变。损伤修复主要包括错配修复、直接修复、切除修复、重组修复和易错修复等。研究发现，GADD45α在细胞DNA损伤修复中具有重要作用。

GADD45α缺失小鼠造血干细胞在电离辐射刺激后DNA修复延迟［39］。在共济失调毛细血管扩张突变基因缺失小鼠的造血干细胞中，GADD45α基因缺失加重细胞DNA损伤［40］。在甲磺酸甲酯诱导DNA损伤后的DNA修复中，GADD45α参与碱基切除修复（base excision repair，BER）过程［38，41］。GADD45α缺失可减少BER，影响无嘌呤无嘧啶核酸内切酶（apurinic/apyrimidinic endonuclease，APE）在胞质定位，并且降低APE和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的相互作用，延缓无嘌呤位点的移除［42］。有机硒诱导人结直肠癌细胞DNA损伤后的BER活性与GADD45α和修复蛋白（PCNA/APE1）相互作用有关。GADD45α蛋白上存在PCNA蛋白结合位点，GADD45α通过与PCNA和DNA修复复合物相互作用调控DNA修复。PCNA与GADD45α的结合位点对于APE和PCNA相互作用调控十分重要，并因此影响BER效果［43］。GADD45α和P21竞争性与PCNA相互作用。在紫外线辐射的角质细胞中，GADD45α下调P21的表达并促进BER进程［26］。

核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）是紫外辐射诱导人体细胞DNA损伤后DNA修复的重要途径。体外实验和细胞实验表明，重组GADD45α可促进NER。GADD45α主要通过识别紫外辐射诱导的细胞染色体结构变化，并调控DNA修复复合物的组装参与NER。GADD45α缺失导致全基因组水平NER功能下降及细胞对DNA损伤应激敏感，如GADD45α缺失的结直肠癌细胞缺失NER功能，同时对紫外辐射和顺铂诱导的DNA损伤应激更加敏感［28，44］。

各种因素诱导细胞应激或DNA损伤后，GADD45α基因的转录激活是GADD45α蛋白发挥细胞调控功能的分子基础。GADD45α通过参与细胞周期、细胞凋亡和DNA修复等功能的调控以维持细胞基因组稳定性。遗传毒性检测系统中应用的人源细胞自身对于DNA损伤刺激因素会做出反馈调节，细胞中GADD45α蛋白通过发挥维持细胞基因组稳定性的调控功能，保障应用于检测系统细胞的存活。

2 GADD45 α遗传毒性检测系统的应用

基于GADD45α在DNA损伤细胞应答调控中的特性和体外毒理学评价发展需求，已研发出基于GADD45α分子调控机制的人源细胞遗传毒性检测系统，并已应用于外源化合物的毒理学评价。该系统在体外遗传毒性化合物检测中具有高度特异性和良好的重复性，被国际生命科学学会健康与环境科学研究所［45］、英国食品消费品和环境化合物致突变委员会［46］及欧洲食品安全局［47］等国际机构认可为一种有效的新化合物体外遗传毒性评价工具。

基于GADD45α分子调控机制构建的遗传毒性检测系统依据报告基因类型，可分为基于荧光蛋白基因表达发出绿色荧光的细胞GSHC（green screen human cells）检测系统和基于荧光素酶发光原理发出蓝色荧光的细胞BSHC（blue screen human cells）检测系统。目前，这2种检测系统均被应用于外源化合物体外遗传毒性评价。

2.1 GSHC检测系统

GSHC检测系统由Hastwell等［7］最初构建，以GFP作为报告基因，将报告质粒转染TK6细胞，以96孔板对外源化合物遗传毒性进行评价。用该检测系统对直接遗传毒性化合物、非整倍体诱发剂、核苷酸合成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂和活性氧簇等34种在其他遗传毒性检测实验中（Ames实验、染色体断裂实验和小鼠淋巴瘤细胞实验等）至少1项呈阳性结果的化合物进行评价。结果显示，31种化合物具有遗传毒性，其中11种GSHC检测阳性的化合物在Ames实验中呈阴性。同时应用GSHC检测系统检测41种遗传毒性阴性的化合物结果均显示为阴性。应用GSHC检测系统对75种药品进行遗传毒性检测并与其他遗传毒性检测方法结果进行比较分析。结果显示，GSHC检测系统的灵敏度高于Ames实验，特异性高于体外哺乳动物细胞基因突变实验，说明GSHC检测系统对于遗传毒性化合物具有良好的检测灵敏度和特异性，可在药物研发工作中用于尚无临床安全评价数据的候选药物对人体潜在遗传毒性评价［48］。应用GSHC检测系统对8种化合物进行遗传毒性评价，由4个实验室分别进行，获得了一致性的结果，说明GSHC检测方法具备可操作性，实验结果有良好的重复性［49］。

应用GSHC检测系统，在添加或不添加S9混合物的条件下，检测欧洲替代方法验证中心（Euro⁃pean Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM）规定的体外遗传毒性检测效果评估化合物列表中62种化合物。化合物共分为3类。第1类化合物是体内遗传毒性阳性化合物，在哺乳动物细胞中检测应得到体外遗传毒性阳性结果；第2类化合物是非DNA效应化合物（包括非遗传毒性致癌物），在哺乳动物细胞中检测应得到体外遗传毒性阴性结果；第3类化合物是非DNA效应化合物（包括非遗传毒性致癌物）、代谢性毒物和其他化合物，在哺乳动物细胞中检测应得到体外遗传毒性阴性结果，但是已有研究报道，其在高浓度或高水平细胞毒性效应条件下遗传毒性检测呈阳性结果。GSHC检测第1类化合物阳性结果占比90%，第2类化合物阴性结果占比96%，第3类化合物中76%呈现阴性结果。一方面说明GSHC检测系统对于遗传毒性化合物具有较好的检测特异性，可有效控制检测结果假阳性率［50］；另一方面提示该检测系统不能应用于非遗传毒性致癌物的检测。

在将16种化合物应用于GSHC检测系统的研究中发现，尽管GADD45α参与DNA损伤应答和细胞凋亡的细胞信号网络调节，但检测结果显示细胞凋亡诱导因素不会导致假阳性结果，说明GSHC检测系统可有效区分遗传毒性因素和凋亡刺激因素［51］。应用GSHC检测系统、SOS显色反应、Mini-Ames实验和微核实验对高德美公司22种化合物进行遗传毒性早期筛选。GSHC检测系统的灵敏度和特异性优于SOS显色反应，检测阳性结果与Mini-Ames实验阳性结果一致，与微核实验阳性结果90%一致，说明GSHC检测系统在候选药物体外遗传毒性早期筛查工作中是一种合适且有效的筛选工具［52］。Johnson等［53］应用GSHC检测系统检测到4种组蛋白脱乙酰化酶抑制剂类药物具有体外遗传毒性效应，推测该类药物的抗肿瘤活性机制可能与其遗传毒性作用相关，为该类药物的研发和管理评价工作提供参考。

2.2 BSHC检测系统

GSHC检测系统应用GFP作为报告荧光，但在应用中发现某些化合物存在自发荧光。因此，干扰检测结果或无法被GSHC检测系统检测［50］。将报告质粒中GFP基因替换为高斯荧光素酶（Gaussia luciferase，GLu）基因构建基于荧光素酶发光原理的BSHC检测系统可有效解决这一问题。GLu报告荧光在特定底物存在时才会产生，由此可实现排除化合物自发荧光的检测干扰。另一方面，因为报告荧光的产生需要底物存在，当不加入底物时，检测系统无荧光产生，由此可对细胞进行荧光标记，实现细胞生长情况的准确监测，为应用BSHC检测系统时减少细胞使用数量提供可能，由此，BSHC检测系统具有高通量检测的可能［54］。

应用BSHC检测系统，在添加或不添加S9混合物的条件下，检测ECVAM规定的体外遗传毒性检测效果评估化合物列表中60种化合物。化合物共分为3类（与GSHC的3类相同，略）。BSHC检测第1类化合物阳性结果占比80%，第2类化合物100%阴性结果，第3类化合物中67.7%呈现阴性结果。说明BSHC检测系统可应用于体外遗传毒性化合物筛选，与GSHC检测系统一样具有较好的检测特异性。应用GSHC检测系统时，第2类化合物中仅有乙二胺四乙酸三钠呈现遗传毒性阳性结果，这可能与螯合剂降低细胞内金属离子浓度的化学特性有关。应用BSHC检测系统时，第2类化合物均未出现遗传毒性阳性结果，说明BSHC检测系统不受螯合剂作用干扰。但在第3类化合物检测结果中，BSHC阴性率低于GSHC检测结果，分析可能的原因，一是与2种检测方法发光原理不同相关，二是与检测化合物的浓度有关［54］。

Simpson等［55］应用384孔板BSHC检测系统检测GSHC检测结果呈阳性或阴性化合物，并综合分析已有研究结果，发现应用此检测系统与96孔板的BSHC及GSHC的检测结果一致。Etter等［56］应用BSHC检测系统对70种香料和香味化合物进行了体外遗传毒性评价，发现相比于常规体外毒性检测方法，BSHC检测系统是一种有效的香料和香味化合物的安全性评价工具，可应用于缺乏常规遗传毒性实验数据资料的化合物体外遗传毒性检测。

应用GSHC和BSHC检测系统评价20种非甾体抗炎药物。结果表明，非甾体抗炎药物不易诱导2种检测系统得出假阳性结果。因为该类药物不是遗传毒性致癌物，由此说明这2种检测系统在体外遗传毒性评价中具有较高的特异性［46］。Scott等［57］应用这2种检测系统评价Ames实验呈阳性结果的硼酸对真核生物的遗传毒性。结果发现，硼酸对于真核细胞仅有微弱或阴性的遗传毒性效应。因此，该研究建议，在将Ames实验呈阳性结果的化合物评价结论推论到人体遗传毒性效应之前还需其他的体外或体内评价数据。

基于GADD45α的分子调控机制构建的遗传毒性检测系统，从最初的GSHC检测系统到BSHC检测系统，从96孔通量到384孔通量，检测方法在不断发展。用于构建检测系统的人源细胞不再局限于TK6。Xin等［58］构建基于荧光素酶的报告质粒，而后转染A549细胞和HepG2细胞，应用这2种携带报告质粒的细胞系可有效检测出MMS、苯并芘和甲醛等化合物的遗传毒性效应，并应用此检测系统实现快速、灵敏的检测炼焦炉提取有机物遗传毒性效应。实验结果表明，该检测系统可在较低浓度下有效检出不同类型环境中遗传毒性物质。相比A549细胞，将报告质粒转染HepG2细胞所构建的检测系统在环境污染物遗传毒性评价中更具应用价值。

3 结语

GADD45α作为细胞生长阻滞和DNA损伤诱导基因，参与细胞周期阻滞、细胞凋亡和细胞衰老等功能调控，在多种因素诱导细胞应激反应调控网络中发挥重要生物学功能。深入研究GADD45α基因及其蛋白的调控功能，有助于揭示遗传毒性因素诱导细胞应答效应的作用机制，为化合物的毒理作用机制研究提供理论基础。基于GADD45α的细胞调控特性构建的遗传毒性检测系统已被应用于化合物体外遗传毒性评价工作，该检测系统对于遗传毒性化合物检测具有良好的特异性、灵敏性和重复性，是一种有效的体外评价工具。但在检测应用中也可能出现某些受试化合物抑制荧光素酶发光反应，从而呈现假阴性结果；受试化合物的细胞毒性过强时会影响检测系统的稳定性。通过对检测系统报告质粒进行改造，对转染细胞进行更多的实验筛选，全面优化检测体系，该检测系统可在药物筛选、环境污染物鉴定和化妆品安全性评价等领域，为化合物的体外毒理学评价提供新的策略。

［1］Wong VC，Morse JL，Zhitkovich A.P53 activation by Ni（II）is a HIF-1α Independent response caus⁃ing caspases 9/3-mediated apoptosis in human lung cells［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2013，269（3）：233-239.

［2］Saletta F，Suryo Rahmanto Y，Siafakas AR，Richardson DR.Cellular Iron depletion and the mechanisms involved in the iron-dependent regula⁃tion of the growth arrest and DNA damage family of genes［J］.J Biol Chem，2011，286（41）：35396-35406.

［3］Dan AL，Hoffman B.Gadd45 Stress Sensor Genes［M］.New York：Springer，2013：1-19.

［4］Thaler R，Spitzer S，Karlic H，Klaushofer K，Varga F.DMSO is a strong inducer of DNA hydroxymethylation in pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells［J］.Epi⁃genetics，2012，7（6）：635-651.

［5］Lee WJ，Kim SC，Lee SJ，Lee J，Park JH，Yu KS，et al.Investigating the different mechanisms of genotoxic and non-genotoxic carcinogens by a gene set analysis［J］.PLoS One，2014，9（1）：e86700.

［6］Zhang L，Yang Z，Liu Y.GADD45 proteins：roles in cellular senescence and tumor development［J］.Exp Biol Med（Maywood），2014，239（7）：773-778.

［7］Hastwell PW，Chai LL，Roberts KJ，Webster TW，Harvey JS，Rees RW，et al.High-specificity and high-sensitivity genotoxicity assessment in a human cell line：validation of the GreenScreen HC GADD45a-GFP genotoxicity assay［J］.Mutat Res，2006，607（2）：160-175.

［8］Walmsley RM，Tate M.The GADD45a-GFP green⁃screen HC assay［J］.Methods Mol Biol，2012，817：231-250.

［9］ Hildesheim J，Fornace AJ.Gadd45a：an elusive yet attractive candidate gene in pancreatic cancer［J］.Clin Cancer Res，2002，8（8）：2475-2479.

［10］Rosemary Siafakas A，Richardson DR.Growth arrest and DNA damage-45 alpha（GADD45alpha）［J］.Int J Biochem Cell Biol，2009，41（5）：986-989.

［11］Schrag JD，Jiralerspong S，Banville M，Jaramillo ML，O′Connor-Mccourt MD.The crystal structure and dimerization interface of GADD45gamma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（18）：6566-6571.

［12］Galichanin K，Svedlund J，Söderberg P.Kinetics of GADD45α，TP53 and CASP3 gene expression in the rat lensin vivoin response to exposure to double threshold dose of UV-B radiation［J］.Exp Eye Res，2012，97（1）：19-23.

［13］ Kádár B，Gombos K，Szele E，Ember I，Iványi JL，Csejtei R，et al.Effects of isoflurane on NF-κB p65，Gadd45a and Jnk1 expression in the vital organs of CBA/CA mice［J］.In Vivo，2011，25（2）：241-244.

［14］Zegura B，Gajski G，Straser A，Garaj-Vrhovac V，FilipicM.Microcystin-LR induced DNA damage in human peripheral blood lymphocytes［J］.Mutat Res，2011，726（2）：116-122.

［15］Cabello CM，Lamore SD，Bair WB，Qiao S，Azimian S，Lesson JL，et al.The redox antimalarial dihydroartemisinin targets human metastatic mela⁃noma cells but not primary melanocytes with induc⁃tion ofNOXA-dependentapoptosis［J］.Invest New Drugs，2012，30（4）：1289-1301.

［16］Cabello CM，Lamore SD，Bair WB，Davis AL，Azimian SM，Wondrak GT.DCPIP（2，6-dichloro⁃phenolindophenol）as a genotype-directed redox chemotherapeutic targeting NQO1*2 breast carci⁃noma［J］.Free Radic Res，2011，45（3）：276-292.

［17］Straser A，FilipicM，Zegura B.Cylindrospermop⁃sin induced transcriptional responses in human hepatoma HepG2 cells［J］.Toxicol In Vitro，2013，27（6）：1809-1819.

［18］Roy S，Deep G，Agarwal C，Agarwal R.Silibinin prevents ultraviolet B radiation-induced epidermal damages in JB6 cells and mouse skin in a p53-GADD45α-dependent manner［J］.Carcinogene⁃sis，2012，33（3）：629-636.

［19］Johnson D，Hastwell PW，Walmsley RM.The in⁃volvement of WT1 in the regulation of GADD45a in response to genotoxic stress［J］.Mutagenesis，2013，28（4）：393-399.

［20］Jin S，Mazzacurati L，Zhu X，Tong T，Song Y，Shujuan S，et al.Gadd45a contributes to p53 sta⁃bilization in response to DNA damage［J］.Onco⁃gene，2003，22（52）：8536-8540.

［21］Takahashi S，Saito S，Ohtani N，Sakai T.Involve⁃ment of the Oct-1 regulatory element of the gadd45 promoter in the p53-independent response to ultraviolet irradiation［J］.Cancer Res，2001，61（3）：1187-1195.

［22］Fan W，Jin S，Tong T，Zhao H，Fan F，Antinore MJ，et al.BRCA1 regulates GADD45 through its interactions with the OCT-1 and CAAT motifs［J］.J Biol Chem，2002，277（10）：8061-8067.

［23］Zhao H，Jin S，Fan F，Fan W，Tong T，Zhan Q. Activation of the transcription factor Oct-1 in re⁃sponse to DNA damage［J］.Cancer Res，2000，60（22）：6276-6280.

［24］Jin S，Fan F，Fan W，Zhao H，Tong T，Blanck P，et al.Transcription factors Oct-1 and NF-YA regu⁃late the p53-independent induction of the GADD45 following DNA damage［J］.Oncogene，2001，20（21）：2683-2690.

［25］Mancini M，Leo E，Aluigi M，Marcozzi C，Borsi E，Barbieri E，et al.Gadd45a transcriptional induction elicited by the aurora kinase inhibitor MK-0457 in Bcr-Abl-expressing cells is driven by Oct-1 tran⁃scription factor［J］.Leuk Res，2012，36（8）：1028-1034.

［26］Gao M，Guo N，Huang C，Song L.Diverse roles of GADD45alpha in stress signaling［J］.Curr Protein Pept Sci，2009，10（4）：388-394.

［27］ChangQ，BhatiaD，Zhang Y，Meighan T，Castranova V，Shi X，et al.Incorporation of an internal ribosome entry site-dependent mechanism in arsenic-induced GADD45 alpha expression［J］.Cancer Res，2007，67（13）：6146-6154.

［28］Tran H，BrunetA，GrenierJM，DattaSR，Fornace AJ，Distefano PS，et al.DNA repair path⁃way stimulated by the forkhead transcription factor FOXO3a through the Gadd45 protein［J］.Science，2002，296（5567）：530-534.

［29］ Sengupta A，Molkentin JD，Paik JH，Depinho RA，Yutzey KE.FoxO transcription factors pro⁃mote cardiomyocyte survival upon induction of oxi⁃dative stress［J］.J Biol Chem，2011，286（9）：7468-7478.

［30］Amente S，Zhang J，Lavadera ML，Lania L，Avvedimento EV，Majello B.Myc and PI3K/AKT signaling cooperatively repress FOXO3a-depen⁃dent PUMA andGADD45α gene expression［J］.Nucleic Acids Res，2011，39（22）：9498-9507.

［31］Paruthiyil S，Cvoro A，Tagliaferri M，Cohen I，Shtivelman E，Leitman DC.Estrogen receptor β causes a G2cell cycle arrest by inhibiting CDK1 ac⁃tivity through the regulation of cyclin B1，GADD45A，and BTG2［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，129（3）：777-784.

［32］Passos JF，Nelson G，Wang C，Richter T，Simillion C，Proctor CJ，et al.Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence［J］.Mol Syst Biol，2010，6（1）：347.

［33］Shao S，Wang Y，Jin S，Song Y，Wang X，Fan W，et al.Gadd45a interacts with aurora-A and in⁃hibits its kinase activity［J］.J Biol Chem，2006，281（39）：28943-28950.

［34］Shih RS，Wong SH，Schoene NW，Zhang JJ，Lei KY.Enhanced Gadd45 expression and delayed G2/M progression are p53-dependent in zinc-sup⁃plemented human bronchial epithelial cells［J］.Exp Biol Med（Maywood），2010，235（8）：932-940.

［35］Pezdirc M，Žegura B，FilipicM.Genotoxicity and induction of DNA damage responsive genes by food-borne heterocyclic aromatic amines in human hepatoma HepG2 cells［J］.Food Chem Toxicol，2013，59：386-394.

［36］Jung HJ，Seo YR.Protective effects of thioredoxinmediated p53 activation in response to mild hyper⁃thermia［J］.Oncol Rep，2012，27（3）：650-656.

［37］Calderon MR，Verway M，Benslama RO，Birlea M，Bouttier M，Dimitrov V，et al.Ligand-depen⁃dent corepressor contributes to transcriptional re⁃pression by C2H2 zinc-finger transcription factor ZBRK1 through association with KRAB-associated protein-1［J］.Nucleic Acids Res，2014，42（11）：7012-7027.

［38］Igotti Abramova MV，Pojidaeva AK，Filippova EA，Gnedina OO，Svetlikova SB，Pospelov VA.HDAC inhibitors induce apoptosis but not cellular senes⁃cence in Gadd45α-deficient E1A+Ras cells［J］.Int J Biochem Cell Biol，2014，51：102-110.

［39］Chen Y，Ma X，Zhang M，Wang X，Wang C，Wang H，et al.Gadd45a regulates hematopoietic stem cell stress responses in mice［J］.Blood，2014，123（6）：851-862.

［40］Chen Y，Yang R，Guo P，Ju Z.Gadd45a deletion aggravates hematopoietic stem cell dysfunction in ATM-deficient mice［J］.Protein Cell，2014，5（1）：80-89.

［41］Jung HJ，Kim EH，Mun JY，Park S，Smith ML，Han SS，et al.Base excision DNA repair defect in Gadd45a-deficient cells［J］.Oncogene，2007，26（54）：7517-7525.

［42］Ma DK，Guo JU，Ming GL，Song H.DNA excision repair proteins and Gadd45 as molecular players for active DNA demethylation［J］.Cell Cycle，2009，8（10）：1526-1531.

［43］Kim HL，Kim SU，Seo YR.A novel role for Gadd45α in base excision repair：modulation of APE1 activity by the direct interaction of Gadd45α with PCNA［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，434（2）：185-190.

［44］Gupta M，Gupta SK，Balliet AG，Hollander MC，Fornace AJ，Hoffman B，et al.Hematopoietic cells from Gadd45a-and Gadd45b-deficient mice are sensitized to genotoxic-stress-induced apopto⁃sis［J］.Oncogene，2005，24（48）：7170-7179.

［45］ Lynch AM，Sasaki JC，Elespuru R，Jacobson-Kram D，Thybaud V，De Boeck M，et al.New and emerging technologies for genetic toxicity test⁃ing［J］.Environ Mol Mutagen，2011，52（3）：205-223.

［46］Allsup J，Billinton N，Scott H，Walmsley RM.Appli⁃cability domain of the GADD45a reporter assays：non-steroidal anti-inflammatory drugs do not pro⁃duce misleading genotoxicity results［J］.Toxicol Res，2013，2（5）：343-351.

［47］European Food Safety Authority Scientific Commit⁃tee.Scientific opinion on genotoxicity testing strate⁃gies applicable to food and feed safety assessment［J］.EFSA J，2011，9（9）：2379-2438.

［48］Hastwell PW，Webster TW，Tate M，Billinton N，Lynch AM，Harvey JS，et al.Analysis of 75 marketed pharmaceuticals using the GADD45a-GFP′GreenScreen HC′genotoxicity assay［J］.Mutagenesis，2009，24（5）：455-463.

［49］Billinton N，Bruce S，Hansen JR，Hastwell PW，Jagger C，Mccomb C，et al.A pre-validation trans⁃ferability study of the GreenScreen HC GADD45a-GFP assay with a metabolic activation system（S9）［J］.Mutat Res，2010，700（1-2）：44-50.

［50］Birrell L，Cahill P，Hughes C，Tate M，Walmsley RM.GADD45a-GFP GreenScreen HC Assay re⁃sults for the ECVAM recommended lists of geno⁃toxic and non-genotoxic chemicals for assessment of new genotoxicity tests［J］.Mutat Res，2010，695（1-2）：87-95.

［51］Topham CH，Billinton N，Walmsley RM.Nongeno⁃toxic apoptosis inducers do not produce mislead⁃ing positive results in the TK6 cell-based GADD45α-GFP genotoxicity assay［J］.Toxicol Sci，2012，128（1）：79-91.

［52］Luzy AP，Orsini N，Linget JM，Bouvier G.Evalua⁃tion of the GADD45α-GFP GreenScreen HC assay for rapid and reliablein vitroearly genotoxicity screening［J］.J Appl Toxicol，2013，33（11）：1303-1315.

［53］Johnson D，Walmsley R.Histone-deacetylase in⁃hibitors produce positive results in the GADD45a-GFP Green Screen HC assay［J］.Mutat Res，2013，751（2）：96-100.

［54］Hughes C，Rabinowitz A，Tate M，Birrell L，Allsup J，Billinton N，et al.Development of a highthroughput Gaussia luciferase reporter assay for the activation of theGADD45α gene by mutagens，promutagens，clastogens，and aneugens［J］.J Biomol Screen，2012，17（10）：1302-1315.

［55］Simpson K，Bevan N，Hastwell P，Eidam P，Shah P，Gogo E，et al.The BlueScreen-384 assay as an indicator of genotoxic hazard potential in earlystage drug discovery［J］.J Biomol Screen，2013，18（4）：441-452.

［56］Etter S，Birrell L，Cahill P，Scott H，Billinton N，Walmsley RM，et al.The‘BlueScreen HC’assay as a decision making test in the genotoxicity as⁃sessment of flavour and fragrance materials［J］.Toxicol In Vitro，2015，29（7）：1425-1435.

［57］Scott H，Walmsley RM.Ames positive boronic acids are not all eukaryotic genotoxins［J］.Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen，2015，777：68-72.

［58］Xin L，Wang J，Wu Y，Guo S.The development of GADD45α luciferase reporter assays in human cells for assessing the genotoxicity of environmen⁃tal pollutants［J］.Toxicol Mech Methods，2015，25（2）：136-142.

GADD45 α in genotoxicity test：molecular principles and research progress

JIN Xi，XI Chao，LIU Kai，LIU Jin
（Experimental Technology Center，College of Life Sciences，Beijing Normal University，Beijing 100875，China）

As a member of growth arrest and DNA damage inducible gene family，GADD45α participats in the regulation of cell cycle，cell senescence，cell survival and apoptosis.GADD45α plays a critical role in the responses to cell injury induced by a variety of factors including cell stress and genotoxic chemicals.Different transcription factors and proteins are involved in transcriptional regulation ofGADD45αgene.GADD45α protein has been implicated in the regulation of genomic stability related cellular responses through interaction with other proteins.Genotoxicity test systems based on the char⁃acteristics ofGADD45α in regulation of cell function，can be applied to the detection of potentially genotoxic compounds，which provides new ideas and methods about genotoxicity assessment.The molecular mechanism and research progress ofGADD45α in genotoxicity test are summarized in this article.

GADD45α；DNA damage；cell cycle；genotoxicity test

LIU Jin，Tel：（010）58808688，E-mail：liujin@bnu.edu.cn

R394.6

A

1000-3002-（2016）09-0989-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.013

Foundation item：The project supported by Fundamental Research Funds for the Central Universities（2013YB49）

2015-09-21 接受日期：2016-07-05）

（本文编辑：贺云霞）

中央高校基本科研业务费专项资金资助（2013YB49）

靳 溪，女，博士，工程师，主要从事遗传毒理学研究，E-mail：jinxi@bnu.edu.cn

刘 进，E-mail：liujin@bnu.edu.cn，Tel：（010）58808688