中毒患者生物检材中卡马西平及其代谢物的气相色谱质谱分析

周丽屏，陈 纠，郭嘉明，刘移民

（广州市职业病防治院职业卫生评价检测中心，广东广州 510620）

中毒患者生物检材中卡马西平及其代谢物的气相色谱质谱分析

周丽屏，陈 纠，郭嘉明，刘移民

（广州市职业病防治院职业卫生评价检测中心，广东广州 510620）

目的 探讨卡马西平（CBZ）在中毒患者不同生物检材中的主要代谢产物及其代谢途径。方法 通过收集广州市职业病防治院1例CBZ中毒患者服用CBZ约6 h后的胃液、血液及尿液，以未服用CBZ的正常人体液作为对照，采用气相色谱质谱法进行分析，用NIST98谱库检索系统对所得质谱图进行图库检索，并根据质谱裂解规律及相关文献报道进行图谱解析，鉴定CBZ代谢物结构，推断其代谢途径。结果在CBZ中毒患者胃液中检出亚氨基茋（M1）1种代谢产物，血液中检出M1、9-甲基吖啶（M2）、9-丙基-9，10-二氢化吖啶（M4）及未知代谢产物M3共4种代谢产物，尿液中检出M1、M2、M4、吖啶（M5）、吖啶酮（M6）、9，10-二氢吖啶（M7）、10，11-环氧卡马西平（M8）、9-吖啶甲醇（M9）、10，11-二羟卡马西平（M10）、2-甲基-吖啶酮（M12）、4-甲基-吖啶酮（M13）及未知代谢产物M3和M11共13种代谢产物。M3和M11代谢产物结构仍需进一步分离及鉴定。在胃液、血液和尿液中，CBZ的代谢物形式存在较大差异，且仅极少量以原药形式在尿液中排出。结论 经过气相色谱质谱分析和图库检索，筛查鉴定出中毒患者体内CBZ的13种代谢产物，并推断其代谢途径。

气相色谱质谱法；卡马西平；代谢物

卡马西平（carbamazepine，CBZ），化学名为5H-二苯并［b，f］氮杂卓艹-5-甲酰胺，是一种三环类抗惊厥药物，临床上常用于治疗癫痫、三叉神经痛以及双相情感障碍等疾病［1］。服用CBZ后可引起头晕、头痛、乏力、复视及昏迷等不良反应，超剂量使用可出现精神错乱、肌肉抽动、震颤、角弓反张、反射异常、心跳加快、呼吸抑制、昏迷、休克甚至死亡［2］。Ju等［3］和朱旭等［4］认为，CBZ在人体内经细胞色素P450酶系代谢为其活性代谢产物，环氧化CBZ及羟基化CBZ，它们再经肝微粒体环氧化物酶进一步转化为无活性的CBZ二元醇等代谢产物，最后通过尿液排出。Mathieu等［5］认为，环氧化物酶的缺乏可能是引起CBZ不良反应的主要原因，其毒性是由活性芳香环氧化中间代谢产物引起。目前，生物检材中CBZ及其代谢物最常用的检测方法为液相色谱法［6-7］、液相色谱质谱联用法［8-9］和液相色谱串联质谱法［10-11］，也有气相色谱法［12］和气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrome⁃try，GC-MS）［13-14］等检测方法。但目前，鲜见对CBZ在人体中代谢产物的定性鉴定及代谢机制的深入研究。对不明原因的昏迷患者，快速确认昏迷原因是临床诊治的迫切需求，考虑到GC-MS具有图库检索功能，因此首选用GC-MS对中毒患者的生物检材进行定性分析。本研究选用CBZ中毒患者的胃液、血液及尿液同时进行测定，旨在研究CBZ进入人体后的代谢途径及机制。本研究采用GC-MS联用仪，液液萃取简单快速的样品前处理方法，经图库检索准确快速鉴定中毒患者生物检材中的未知毒物及其代谢物，为毒物鉴定提供推断基础，为临床快速诊治提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

乙酸乙酯（色谱纯），德国Merck公司；甲醇（色谱纯），德国CNW科技公司；CBZ（纯度≥99.5%），德国Dr.Ehrensorfer公司。

6890-5973N气相色谱质谱联用仪和DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美国Agilent公司；HGC-12A氮吹浓缩仪，天津恒奥科技发展有限公司；TG20台式离心机，长沙英泰仪器有限公司；V8涡旋混合器，美国安胜（Essenscien）仪器公司；AX200万分之一天平，日本岛津公司；10和50 μL微量注射器，澳大利亚SGE公司。

1.2 样品来源

患者，男，72岁，不明原因昏迷被送入广州市职业病防治院。家属述患者有精神病史，曾服用CBZ 3年，停药近半年。家属发现患者出现恶心呕吐症状，呕吐物有白色粉末，逐渐意识不清，被家属送院救治。入院后以胃管经鼻抽取患者胃液；采集静脉血约4 mL于普通干燥采血管中；用导尿管采集尿液，样品采集时距离患者口服毒物约6 h。该患者的胃液、血液及尿液送实验室检测。

1.3 样品前处理

1.3.1 尿液和胃液的前处理

取2 mL尿液或胃液，加入3 mL乙酸乙酯，涡旋3 min，离心（1073×g，25℃）3 min，准确量取上清2 mL，氮吹浓缩至近干，用微量注射器准确加入50 μL乙酸乙酯，待进样分析。

1.3.2 血样的前处理

普通干燥管采血后，离心（1073×g，25℃）3 min，取2 mL血清，其他步骤按1.3.1操作。

1.4 GC-MS检测条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：230℃；柱温：80℃，保持3 min，以10℃∙min-1升到220℃，保持2 min，再以15℃∙min-1升到250℃，保持15 min，以5∶1的分流比进样；进样量：2 μL；载气：高纯氦气；采用恒流模式，柱流量：1.0 mL∙min-1。

1.4.2 质谱条件

离子源：电子轰击（EI）源；离子源温度：230℃；辅助接口温度：280℃；EI电压：69.9 eV；扫描方式：Scan；扫描质荷比（m/z）范围：33~400 amu；质谱调谐：自动调谐；溶剂延迟：3.5 min。

1.5 GC-MS图谱解析

用EI源GC-MS联用仪对样品进行检测，对质谱图进行图库（美国国家科技研究所NIST 98质谱数据库）检索和特征离子峰分析，结合分子结构和裂解规律及相关文献报道的代谢物进行图谱解析。本文所有分子结构图均采用ChemDraw Ultra 7.0软件绘制。

2 结果

2.1 GC-MS分析结果

按1.4项下GC-MS条件对患者处理后的体液样本进行分析，胃液、血液和尿液中的内源性物质不干扰样品的分离测定（图1）。图库检索结果见表1。

2.2 图谱解析CBZ的代谢产物

Fig.1 Total ion chromatorgrams of human gastric juice（A），human serum（B）and human urine（C）by gas chromatorgraphy-mass spectrometry.Black line：total ion chromatorgraphy of test samples；red line：total ion chromatorgraphy of blank samples.

Tab.1 Summary of metabolites of carbamazepine detected in three biological samples using NIST98 mass spectral library search system

根据谢岑等［15］报道的反应性代谢物分析原理，结合文献［6，8，16-17］报道的CBZ及其主要代谢物的代谢途径及机制，对胃液、尿液及血液提取液的总离子流图进行图谱解析。由GC-MS图库检索可得到11种CBZ代谢产物，而M3和M11未有与之匹配的化合物图库，根据图2A和2B的特征离子图结合文献资料推断其分子结构的可能存在形式（图2C和2D），但具体结构确认还有待进一步分离及鉴定。13种CBZ代谢产物中，M8和M10是最常被报道的，且已有较多文献报道以高效液相色谱及其联用技术对M8和M10进行定量分析。Breton等［8］已报道CBZ代谢产物亚氨基茋（iminostilbene，M1），M3，吖啶（acridine，M5）和吖啶酮（acridone，M6）在体内的代谢途径。其他7种化合物则很少被报道为CBZ的代谢产物。从表1可见，在胃液提取液中未检出9-甲基吖啶（M2）~4-甲基-吖啶酮（M13），表明这12种化合物不是以CBZ的杂质存在，而是经过人体代谢所产生的。

Fig.2 Mass spectra of M3（A），M11（B）and chemical structures of M3（C）and M11（D）.RMM：relative molecular mass.

由图2A和2C推断，m/z207为M3的分子离子峰，物质较稳定。因此分子离子峰较为明显，m/z207为奇数，分子含氮数为奇数，符合“氮律”。m/z207首先失去CO（m/z28）使六元环开环并重排，因此得m/z179的碎片峰，再失去C2H4（m/z28）得m/z151碎片峰。由图2B和2D推断，m/z283为M11的分子离子峰，物质较稳定。因此分子离子峰较为明显，m/z283为奇数，分子含氮数为奇数，符合“氮律”。m/z283首先失去OH（m/z17）得m/z266的碎片峰，再失去NCONH2（m/z58）得m/z208碎片峰，最后环氧脱H2O（m/z18），形成m/z为180的碎片峰。

本研究在CBZ中毒患者的尿液中检出M2，9-丙基-9，10-二氢吖啶（M4），9，10二氢吖啶（M7），9-吖啶甲醇（M9），M11，2-甲基-吖啶酮（M12）及M13，并对其代谢途径进行推断及解释。从表1和图1C可见，CBZ进入人体后，经过代谢，只有极少量以CBZ形式在尿液中排出，且大多以M1，M2，M3和M5的代谢产物形式排出；其次以M4，M8和M11的代谢产物形式排出；从图1B可见，CBZ在血清中的主要代谢产物为M1和M3，而M2和M4的含量很低。

2.3 CBZ代谢途径分析

依据本研究结果推断，CBZ其他代谢产物的生成途径如图3。从表1可见，胃液的提取物成分比较简单，除常见的有机酸外，检出的主要成分为M1和CBZ，其中M1是合成CBZ的主要药物中间体，根据药物在人体的反应代谢原理推断，CBZ进入人体胃部中受胃酸的作用，发生去N-氨基甲酰基反应，生成亚氨基茋。CBZ在细胞色素P450的作用下，发生环氧化反应生成M8，而M8在人体内又可发生水解反应生成M10。Breton等［8］报道了在白细胞的氧化作用下，CBZ和M1更倾向于生成M9，M5和M6，这一结果与本研究结果一致。

Fig.3 Proposed metabolic pathways of carbamazepine in humans.

3 讨论

一般用于液液萃取的溶剂首先要与被萃取基质互不相溶，其次根据相似相溶原理需考虑目标提取物的极性、水溶性及脂溶性等特点。对于大多数药物来说，在研发过程中为了提高其生物利用度，要求药物在吸收部位必须具有一定的水溶解度，因为人体的介质是水，水是药物转运的载体，而细胞膜的双脂质层的结构，要求药物有一定的脂溶性才能穿透细胞膜。本研究对比了三氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯的相对萃取效率。结果表明，乙酸乙酯对尿液和胃液有较高的萃取效率，原因在于CBZ易溶于乙醇和丙酮等极性溶剂，难溶于水，而乙酸乙酯水溶解性和极性较三氯甲烷和正己烷强。因此，在尿液和胃液中的分散程度较好，对CBZ的溶解度也较三氯甲烷和正己烷高。由于受采血量限制，本研究并未对血清的提取进行优化对比，但本研究旨在快速筛查中毒原因以及毒物进入人体后的代谢途径及机制。因此，乙酸乙酯作为提取溶剂已能满足要求。

综上所述，该法前处理简单，通过GC-MS分离及图库检索，可快速筛查中毒患者的中毒原因，结果准确可靠。CBZ进入人体后，经过代谢，在尿中极少以CBZ形式排出，其主要以M1，M2，M3和M5代谢物形式排出。在尿中的13种CBZ代谢产物中有11种经图库检索可确定结构，另2种（M3和M11）代谢产物结构仍需进一步分离及鉴定。

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Determination of carbamazepine and its metabolites in biological samples from a poisoned patient by GC-MS analysis

ZHOU Li-ping，CHEN Jiu，GUO Jia-ming，LIU Yi-min
（Evaluation and Testing Center for Occupational Hygiene，Hospital of Prevention and Treatment for Occupational Diseases，Guangzhou 510620，China）

OBJECTIVE To investigate the forms of carbamazepine and its metabolites in the gastric juice，blood and urine samples from a poisoned patient and its metabolic pathways.METHODS The gastric juice，blood and urine samples were obtained from a patient who was rushed to the Hospital of Prevention and Treatment for Occupational Diseases to be treated for an overdose of carbamazepine for about six hours.The samples were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry.The metabolites were identified from their mass spectra by comparison with spectra in NIST 98 libraries. The metabolic pathways were inferred by fragmentation regularities of mass spectra and the published data.RESULTS The results showed that only M1 was found in the gastric juice sample.Four metabo⁃lites，such as iminostilbene（M1），9-methyl-acridine（M2），9-propyl-acridan（M4）and M3，were found in the blood sample and thirteen metabolites，including M1，M2，M4，acridine（M5），acridone（M6），9，10-dihydro Acridine（M7），1a，10b-dihydro-6H-dibenz［b，f］oxireno［d］azepine-6-carboxamide（M8），9-acridinemethanol（M9），10，11-dihydrodiol-carbamazepine（M10），2-methyl-acridone（M12），4-methyl-acridone（M13），undetermined M3 and M11，were found in the urine from the poi⁃soned patient.The forms of carbamazepine metabolites in the gastric juice，blood and urine were different. Little carbamazepine was found in the urine after metabolism.CONCLUSION Based on the analysis by gas chromatography-mass spectrometry and identification of NIST 98 libraries，the metabolites could be identified accurately，which can help analyze the metabolic mechanism and pathways of carbam⁃azepine.

gas chromatography-mass spectrometry；carbamazepine；metabolites

LIU Yi-min，E-mail：ymliu61@163.com，Tel：（020）38981264

R969.1

A

1000-3002-（2016）09-0961-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.009

Foundation item：The project supported by Laboratory Construction Project of Occupational Environment and Health Effect in Guangzhou City（2014SY000020）

2015-12-18接受日期：2016-07-11）

（本文编辑：沈海南）

广州市职业环境与健康效应实验室建设项目（2014SY000020）

周丽屏，（1981-），女，硕士研究生，分析化学工程师，理化检验主管技师，主要从事职业卫生检测及化学中毒应急救援检测工作。

刘移民，E-mail：ymliu61@163.com，Tel：（020）38981264