氯吡硫磷染毒撤除对原代培养大鼠海马神经元细胞毒性的延迟效应

吴春燕，闫长会，傅风华，关勇彪

（1.烟台大学药学院，山东烟台 264005；2.军事医学科学院毒物药物研究所，国家北京药物安全评价与研究中心，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

氯吡硫磷染毒撤除对原代培养大鼠海马神经元细胞毒性的延迟效应

吴春燕1，2*，闫长会2*，傅风华1，关勇彪2

（1.烟台大学药学院，山东烟台 264005；2.军事医学科学院毒物药物研究所，国家北京药物安全评价与研究中心，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

目的 探讨低浓度氯吡硫磷（毒死蜱，CPF）染毒撤除对原代培养海马神经元细胞毒性的延迟效应。方法 原代培养海马神经元经CPF 10和30 μmol·L-1连续染毒72 h，或连续染毒48 h后更换无CPF的培养液继续培养24 h，运用CCK-8试剂盒检测海马神经元的存活；用神经元核（NeuN）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）和βⅢ微管蛋白免疫荧光染色法检测海马不同发育阶段神经元数量。结果 原代培养海马神经元经CPF 10和30 μmol·L-1连续染毒72 h，与正常对照组相似，未检测到明显神经元死亡；而CPF 10和30 μmol·L-1连续染毒48 h撤除后24 h，与正常对照组相比，出现细胞破裂、突触断裂现象，且海马神经元数目明显减少（P<0.05），神经元的存活率明显下降（P<0.05），BrdU和βⅢ微管蛋白表达阳性细胞的数量明显减少（P<0.05）。结论 CPF 10和30 μmol·L-1染毒撤除后对大鼠海马神经元细胞毒性具有延迟效应。

有机磷杀虫剂；氯吡硫磷；海马；神经元，培养的

目前，有机磷杀虫剂（organophosphorus pes⁃ticides，OP）在世界范围内仍广泛使用，环境中的低剂量OP持续暴露给人类健康带来危害［1］。流行病学研究资料显示，OP暴露后能诱发慢性神经毒性，其中最为常见的是与学习记忆和注意力下降相关的认知功能障碍［2-5］，而该症状一般在脱离OP暴露的一段时间后才出现［6］。这种现象在人类和动物中均有发生［7-10］。这种OP撤除诱导的迟发性中枢神经毒性作用机制尚不明确。氯吡硫磷（毒死蜱，chlorpyrifos，CPF）自2007年之后成为我国对硫磷和甲胺磷等高毒性OP的替代品。在我国的农副产品中，CPF是能被检测出的主要残留成分和超标成分。因此，CPF中枢神经毒性的研究对于农药引起的健康风险评估具有重要意义。本研究观察CPF染毒撤除后原代培养的大鼠海马神经元的细胞毒性反应，探讨OP对中枢神经系统的毒性作用特点。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

B-27添加剂〔B-27 Supplement（50×）〕、N-2添加剂〔N-2 Supplement（50×）〕、马血清、DMEM/ F12、神经基础培养基及PBS购自美国Gibco公司；DHanks液、多聚赖氨酸和FUDR购自美国Sigma公司；胎牛血清购于四季青公司；CCK-8试剂盒购自日本DOjinDO株式会社；牛血清白蛋白由瑞士Roche公司提供；兔抗神经元核（neuronal nuclei，NeuN）、兔抗βⅢ微管蛋白和大鼠抗5-溴脱氧尿苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）一抗以及山羊抗大鼠荧光标记二抗（Alexa Fluor®488）和山羊抗兔荧光标记二抗（Alexa Fluor®594）均购自美国Abcam公司；大鼠神经生长因子（nerve growth factor，NGF）由美国Pepro Tech公司提供；台盼蓝购自北京索来宝公司；DAPI购自美国Molecular Probes公司；其他试剂均为国产分析纯。CKX41倒置显微镜和IX70倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯株式会社），MCO-175 CO2培养箱（日本三洋电器集团），Ti-A1倒置共聚焦显微镜和SMZ745T解剖显微镜（日本尼康公司），Victor3 1420型多标记酶标仪（芬兰铂金埃尔默仪器有限公司）。

1.2 胎鼠海马神经元原代培养和鉴定

胎鼠海马神经元制备参照Tan等［11］和Zhang等［12］方法并略加修改。在无菌条件下取胎龄16~ 18 d胎鼠，短暂浸泡乙醇消毒后，剪下头部置于装有预冷D-Hanks液的培养皿中，迅速解剖大脑，分离海马，仔细剥离微血管和血管膜后将海马组织剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm碎片。胰蛋白酶37℃消化8 min，马血清终止消化。分步吹打法收集单细胞悬液，800×g离心10 min后弃上清，加入含胎牛血清的DMEM/F12接种培养液重悬，计数后按照一定数量接种至经多聚赖氨酸包被的不同规格培养板中。6 h后全量更换无血清维持培养液，以后2~3 d半量更换1次培养液。配制接种培养液：DMEM/F12培养液、10%马血清（热灭活）、10%胎牛血清（热灭活，过滤）、青霉素100 kU·L-1和链霉素100 mg·L-1。配制维持培养液：①DMEM/F12培养液含10%马血清（热灭活）、2%B-27、1%N-2、青霉素50 kU·L-1和链霉素100 mg·L-1；②神经基础培养基含2%B-27、青霉素50 kU·L-1和链霉素100 mg·L-1。在培养第7天采用抗NeuN抗体进行免疫组化染色鉴别神经元纯度，纯度>90%时进行下一步实验。

1.3 细胞形态观察

细胞接种后，分别在不同时间将细胞培养板放在倒置显微镜下观察神经元形态，并拍照标记。细胞培养第7天，进行CPF染毒。CPF经DMSO溶解后，用培养液稀释至10和30 μmol·L-1，DMSO终浓度为0.5%。吸除旧培养液，加入含CPF的培养液。持续染毒组在染毒72 h后观察细胞形态并拍照标记；染毒撤除组在CPF染毒48 h后，更换不含CPF的常规神经基础培养液继续培养24 h，与持续染毒组一起观察细胞形态，并拍照标记。同时设正常对照组和溶剂对照组，正常对照组为正常完全神经基础培养液培养的神经元，溶剂对照组为含0.5%DMSO的神经基础培养液培养的神经元。

1.4 CCK-8检测细胞存活

使用CCK-8试剂盒检测细胞存活。细胞培养第7天，持续染毒组经CPF染毒72 h，吸除所有培养液，将CCK-8试剂以1∶10比例与新鲜的神经基础细胞维持培养液混合均匀，每孔中加入110 μL该混合液，避免产生气泡。将培养板放入培养箱中孵育一定时间。使用酶标仪测定吸光度值。染毒撤除组在CPF染毒48 h，吸除所有上清液，PBS清洗3次后，补充新鲜的不含CPF的常规神经基础培养液继续培养24 h，与持续染毒组一起进行吸光度值（A450nm）测定。存活率（%）=（A实验孔-A空白孔）/（A对照孔-A空白孔）×100%，其中，实验孔含细胞培养液、CCK-8和CPF；对照孔含细胞培养液和CCK-8，无CPF；空白孔含细胞培养液，无细胞、CPF和CCK。

1.5 免疫荧光法检测细胞活性

染毒流程同1.4。持续染毒组在染毒72 h后，染毒撤除组在持续染毒48 h撤除CPF再正常培养24 h后，一并进行免疫荧光染色实验。具体操作步骤如下：吸除培养液，用PBS漂洗细胞3次后，每孔中加入4%多聚甲醛350 μL固定细胞25 min；弃去多聚甲醛，加入甘氨酸0.1 mol·L-1，每孔400 μL，室温孵育7 min；弃甘氨酸，每孔加入500 μL预冷PBS，洗3次；0.5%Triton X-100室温通透20 min，每孔加入500 μL预冷PBS，洗3次；弃PBS，加入相应一抗（抗NeuN、BrdU或βⅢ微管蛋白一抗），4℃湿盒过夜；PBS浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加已稀释的荧光二抗，避光，湿盒中20~37℃孵育1 h；每孔500 μL预冷PBS浸洗3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBS 5 min洗4次洗去多余DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在激光共聚焦显微镜下观察采集图像。

1.6 统计学分析

实验结果数据均以x±s，表示，应用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析及Dunnettt检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CPF持续染毒48 h后和染毒撤除对海马神经元形态的影响

普通光镜下观察发现（图1），正常对照组和溶剂对照组神经元生长状况均良好。CPF 10和30 μmol·L-1连续染毒72 h后，神经元生长与正常对照组相比无明显变化，神经元胞体饱满，突触网络清晰可见，无死亡细胞碎片。持续暴露48 h后撤除CPF继续培养24 h，CPF 10 μmol·L-1染毒撤除组与正常培养组和溶剂对照组相比，显示神经元数目减少，并出现细胞碎片、突触断裂；CPF 30 μmol·L-1染毒撤除组上述情况更加严重。由此提示，CPF 10 μmol·L-1撤除染毒条件下，原代培养海马神经元的细胞毒性反应明显大于相同剂量的持续染毒组。

2.2 CPF持续染毒和染毒48 h后撤除对海马神经元存活率的影响

Fig.1 Morphological changes in rat primary hippocampal neurons treated with chlorpyrifos（CPF）for 72 h or CPF exposure for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h（200×）.Hippocampal neurons were prepared from SD rat fetuses on the 17thday of gestation.Seven days after culture，neurons were treated with CPF for the indicated time.A1：normal control；A2：vehicle control；B1 and B2：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，continuous exposure for 72 h；C1 and C2：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，exposure for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h.Arrows show broken synapse or cell debris.

CCK-8检测结果显示（图2），CPF 10 μmol·L-1持续染毒72 h神经细胞存活率为（100.9±18.6）%；而CPF处理48 h后撤除继续培养24 h，神经细胞存活率降低为（69±14）%（P<0.01）。同样，CPF 30 μmol·L-1持续染毒72 h后神经细胞存活率为（91±12）%，而CPF撤除组细胞存活率降低为（37± 5）%（P<0.01）。由此表明，CPF 10和30 μmol·L-1持续暴露72 h对神经细胞存活率未见明显影响；而染毒48 h后撤除继续培养24 h，神经细胞存活率明显降低，提示CPF暴露对海马神经元存在延迟性细胞毒性作用。

Fig.2 Changes of survival of rat primary hippocampal neurons after CPF continuous exposure for 72 h（A）and CPF exposure for 48 h followed by CPF with⁃drawal for 24 h（B）.See Fig.1 for the treatment.x±s，n=5. *P<0.05，compared with corresponding A group.

2.3 CPF持续染毒和染毒48后撤除对海马神经元活性的影响

经BrdU和NeuN免疫荧光双染色（图3，表1），以及BrdU和βⅢ微管蛋白免疫荧光双染色（图4，表2），海马神经元在含有CPF 10和30 μmol·L-1的培养液中持续培养72 h，仅βⅢ微管蛋白阳性表达的神经元细胞数目与正常对照组相比减少（P<0.05），BrdU和NeuN阳性表达的细胞数目与正常对照组相比无明显差异；而CPF撤除组BrdU和βⅢ微管蛋白阳性表达的细胞数目与正常对照组和等浓度CPF持续培养组相比显著减少（P<0.05），提示海马神经元BrdU和βⅢ微管蛋白的表达活性均降低。

Tab.1 Changes in amount of 5-bromodeoxyuridine（BrdU）positive cells and neuronal nuclei（NeuN）positive cells in rat primary hippocampal neurons after CPF continuous exposure for72 h and CPF exposure for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h

Tab.2 Amount of BrdU and βⅢ tubulin positive cells in rat primary hippocampal neurons decreased after CPF withdrawal

Fig.3 Changes in amount of BrdU positive cells and NeuN positive cells in rat primary hippocampal neurons after CPF continuous exposure for 72 h and CPF exposure for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h.See Fig.1 for the treatment.A：NeuN negative control；B：BrdU negative control；C：normal control；D and E：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，continuous exposure for 72 h；F and G：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，exposure for 48 h followed by CPF with⁃drawal for 24 h.

Fig.4 BrdU positive cells and βⅢ tubulin positive cells in rat primary hippocampal neurons decreased after CPF withdrawal.See Fig.1 for the treatment.A：βⅢ tubulin negative control；B：BrdU negative control；C：normal control；D and E：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，continuous exposure for 72 h；F and G：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，expo⁃sure for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h.

3 讨论

近年来，不断有研究发现CPF暴露会引起学习记忆等认知功能的减退［13-14］。但CPF暴露所致的中枢神经系统损害多见于流行病学调查报告，直接的实验证据比较缺乏。低剂量CPF长期暴露会导致认知功能障碍和其他神经学异常症状，其机制尚不明确，但可以明确的是非胆碱能机制在其中起着重要作用。迄今为止，国际上对于CPF神经毒性作用机制的研究主要包括：①谷氨酸盐介导的兴奋性毒性；②改变与分化相关的生物标志基因的表达；③改变海马中神经营养素和神经递质的表达及影响轴突中线粒体输运等［15-18］。然而这些推测仍需进一步验证。

本课题组前期研究了CPF浓度与时间的效应。结果表明，CPF 10和30 μmol·L-1持续染毒72 h对原代培养海马神经元无明显的毒性作用［11，20］。故本研究在此基础上确定CPF对海马神经元的染毒浓度和时间。结果表明，CPF 10和30 μmol·L-1连续染毒72 h未见海马神经元明显的细胞毒性，而在CPF 48 h连续染毒并撤除24 h后，却诱发海马神经元明显的细胞毒性，表现为细胞形态明显改变（胞碎片、突触断裂增加）、细胞数目减少及细胞活性降低。

NeuN，BrdU和βⅢ微管蛋白分别为成熟神经元、神经前体细胞和新生神经元的特异性标志物。本研究用免疫荧光染色对NeuN、BrdU和βⅢ微管蛋白阳性细胞进行计数。结果显示，BrdU阳性表达细胞和βⅢ微管蛋白阳性表达细胞均显著减少，说明不同发育阶段神经元数目减少，表明CPF撤除能够引起神经细胞的减少，细胞活性降低。CCK-8法检测细胞存活率，结果亦表明，CPF 10和30 μmol·L-1持续染毒72 h细胞存活率未见明显降低，CPF撤除后细胞存活率明显降低。结合以上3种检测方法的实验结果，提示CPF持续暴露并不会立即引起神经元细胞的死亡，而是在药物撤除后24 h才出现神经元死亡，CPF撤除诱发原代海马神经元细胞毒性反应可能并不是由CPF直接毒性作用引起的。

由于大脑中执行空间学习记忆功能的主要部位为海马，海马对于学习记忆起重要作用并可影响自主神经系统，海马的损伤将导致认知功能障碍与情绪改变［18］。我们前期的研究结果也证实，CPF染毒后大鼠出现学习记忆障碍及自发行为改变［19-20］。本研究进一步发现，低浓度CPF连续染毒后撤除可以诱发明显的细胞毒性。这种CPF撤除导致的细胞毒性延迟作用可能与CPF的直接毒性作用无关，其具体机制还需要进一步研究。本研究为揭示以CPF为例的OP神经毒性作用机制提供了新的思路。

［1］Cole TB，Fisher JC，Burbacher TM，Costa LG，Furlong CE.Neurobehavioral assessment of mice following repeated postnatal exposure to chlorpyrifosoxon［J］.Neurotoxicol Teratol，2012，34（3）：311-322.

［2］Abou-Donia MB.Organophosphorus ester-induced chronic neurotoxicity［J］.Arch EnvironHealth，2003，58（8）：484-497.

［3］Alavanja MC，Hoppin JA，Kamel F.Health effects of chronic pesticide exposure：cancer and neuro⁃toxicity［J］.Annu Rev Public Health，2004，25：155-197.

［4］Jamal GA，Hansen S，Julu PO.Low level exposures to organophosphorus esters may cause neurotoxicity［J］.Toxicology，2002，181-182（6）：23-33.

［5］Kamel F，Hoppin JA.Association ofpesticide exposure with neurologic dysfunction and disease［J］.Environ Health Perspect，2004，112（9）：950-958.

［6］Mullins RJ，Xu S，Pereira EF，Mamczarz J，Albuquerque EX，Gullapalli RP.Delayed hippo⁃campal effects from a single exposure of prepubertal guinea pigs to sublethal dose of chlorpyrifos：a magnetic resonance imaging and spectroscopy study［J］.Neurotoxicology，2013，36（9）：42-48.

［7］Stephens R，Spurgeon A，Calvert IA，Beach J，Levy LS，Berry H，et al.Neuropsychological effects of long-term exposure to organophosphates in sheep dip［J］.Lancet，1995，345（8958）：1135-1139.

［8］Bazylewicz-Walczak B，Majczakowa W，Szymczak M. Behavioral effects of occupational exposure to organophosphorous pesticides in female greenhouse planting workers［J］.Neurotoxicology，1999，20（5）：819-826.

［9］Bushnell PJ，Kelly KL，Ward TR.Repeated inhibition of cholinesterase by chlorpyrifos in rats：behavioral，neurochemicaland pharmacologicalindicesof tolerance［J］.J Pharmacol Exp Ther，1994，270（1）：15-25.

［10］Terry AV，Stone JD，Buccafusco JJ，Sickles DW，Sood A，Prendergast MA.Repeated exposures to subthreshold doses of chlorpyrifos in rats：hippo⁃campal damage，impaired axonal transport，and deficits in spatial learning［J］.J Pharmacol Exp Ther，2003，305（1）：375-384.

［11］Tan DH，Peng SQ，Wu YL，Wang YM，Lu CF，Ding W，et al.Chlorpyrifos induces delayed cyto⁃toxicity after withdrawal in primary hippocampal neurons through extracellular signal-regulated kinase inhibition［J］.Biol Pharm Bull，2009，32（10）：1649-1655.

［12］Zhang B，Wang RZ，Lian ZG，Song Y，Yao Y. Neurogenesis by activation ofinherentneural stem cells in the rat hippocampus after cerebral infarction［J］.Chin Med Sci J，2009，24（1）：41-45.

［13］Middlemore-Risher ML，Adam BL，Lambert NA，Terry AV Jr.Effects of chlorpyrifos and chlorpyrifosoxon on the dynamics and movement of mitochon⁃dria in rat cortical neurons［J］.J Pharmacol Exp Ther，2011，339（2）：341-349.

［14］Peris-Sampedro F，Salazar JG，Cabre M，Reverte I，Domingo JL，Sanchez-Santed F，et al.Impaired retention in Abeta PP Swedish mice six months after oral exposure to chlorpyrifos［J］.Food Chem Toxicol，2014，72：289-294.

［15］Rush T，Liu XQ，Hjelmhaug J，Lobner D.Mecha⁃ nisms of chlorpyrifos and diazinon induced neuro⁃toxicity in cortical culture［J］.Neuroscience，2010，166（3）：899-906.

［16］Lee YS，Lewis JA，Ippolito DL，Hussainzada N，Lein PJ，Jackson DA，et al.Repeated exposure to neurotoxic levels of chlorpyrifos alters hippocampal expression of neurotrophins and neuropeptides［J］.Toxicology，2016，340：53-62.

［17］ Estevan C，Fuster E，Del Río E，Pamies D，Vilanova E，Sogorb MA.Organophosphorus pesti⁃cide chlorpyrifos and its metabolites alter the expression of biomarker genes of differentiation in D3 mouse embryonic stem cells in a comparable way to other model neurodevelopmental toxicants［J］.ChemRes Toxicol，2014，27（9）：1487-1495.

［18］Slotkin TA，Cooper EM，Stapleton HM，Seidler FJ. Does thyroid disruption contribute to the develop⁃mental neurotoxicity of chlorpyrifos？［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2013，36（2）：284-287.

［19］Lazarov O，Hollands C.Hippocampal neurogenesis：learning to remember［J］.Prog Neurobiol，2016，138-140：1-18.

［20］Yan CH，Jiao LF，Zhao J，Yang HY，Peng SQ. Repeated exposures to chlorpyrifos lead to spatial memory retrieval impairment and motor activity alteration［J］.Neurotoxicol Teratol，2012，34（4）：442-449.

Chlorpyrifos exposure withdrawal induces delayed cytotoxicity in rat primary hippocampal neurons

WU Chun-yan1，2*，YAN Chang-hui2*，FU Feng-hua1，GUAN Yong-biao2
（1.School of Pharmacy，Yantai University，Yantai 264005，China；2.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，National Beijing Center for Drug Safety Evaluation and Research，Institute of Pharmacology of Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTIVE To investigate the delayed cytotoxicity effect of chlorpyrifos（CPF）with⁃drawal on primary hippocampal neurons.METHODS Hippocampal neurons were prepared from SD rat fetuses on the 17thday of gestation.Seven days after culture，neurons were exposed to CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，for 72 h or for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h.CCK-8 kit and neuronal nuclei（NeuN），5-bromodeoxyuridine（BrdU）and βⅢ tubulin immunofluorescence expression methods were used to evaluate the cell viability.RESULTS Compared with normal control，no significant cytotoxicity was found after CPF 72 h continuous exposure.However，CPF 48 h expo⁃sure followed by CPF withdrawal for 24 h induced evident cytotoxicity.The amount of BrdU positiveand βⅢ tubulin positive hippocampal neurons were both decreased significantly（P<0.05），and cell survival and viability reduced after CPF withdrawal.CONCLUSION CPF exposure withdrawal can induce more seriously delayed cytotoxicity than continuous exposure in rat primary hippocampal neurons.

organophosphorus insecticides；chlorpyrifos；hippocampus；neurons，cultured

FU Feng-hua，E-mail：fenghua@luye.cn；GUAN Yong-biao，E-mail：guanyb@hotmail.com，Tel：（010）66931630

R996

A

1000-3002-（2016）09-0941-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.006

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81373035）

2016-05-25接受日期：2016-08-08）

（本文编辑：齐春会）

国家自然科学基金（81373035）

吴春燕，女，硕士研究生，主要从事药理毒理研究，E-mail：xiaomao411@126.com；闫长会，女，助理研究员，E-mail：yanchanghui2002@163.com，主要从事药物毒性研究。

傅风华，E-mail：fenghua@luye.cn；关勇彪，E-mail：guanyb@hotmail.com,Tel:(010)66931630

*共同第一作者。

*Co-first author.