臭氧氧化与缺血再灌注损伤的研究进展①

陶希，黄靓，蔡华安，邓景贵

臭氧氧化与缺血再灌注损伤的研究进展①

陶希，黄靓，蔡华安，邓景贵

臭氧作为一种活性氧，具有诱导氧化应激作用，而小剂量臭氧预处理可使机体产生氧化耐受，甚至抗氧化损伤作用，从而保护器官缺血再灌注损伤。本文综述了臭氧预处理在心脏、肾脏、肝脏、骨骼肌、性腺及脑等器官缺血再灌注的研究现状，认为臭氧治疗在器官移植和心脑血管病具有潜在应用价值。同时，就近10年臭氧大自血疗法在缺血性脑血管病的临床应用是否合理的问题，提出疑问和思考。

臭氧氧化；缺血再灌注损伤；缺血性脑血管病；综述

[本文著录格式]陶希，黄靓，蔡华安，等.臭氧氧化与缺血再灌注损伤的研究进展[J].中国康复理论与实践,2016,22(12): 1420-1424.

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臭氧(O3)作为一种“可选择性的”或“补充的”医学治疗手段存在有100余年历史，如同有着3000年历史的“中医药”，其有效性和可能存在的风险正在被现代临床医学研究所证实[1]。起初，O3治疗是基于其对厌氧菌的强大杀菌效果，随着研究的深入，人们发现O3能调节多种细胞的功能代谢，不仅在骨关节病、口腔、肿瘤等领域有较多报道[2-4]，而且O3大自血疗法治疗急性期脑梗死患者亦有一定疗效[5]。但是，O3作为一种活性氧(reactive oxygen species,ROS)，具有诱导氧化应激效应，在主流医学领域一直备受争议。原因主要与其作用机制及风险等基础研究不足有关。

1 O3理化特性

O3是氧气(O2)的同素异形体，拥有特殊臭味，常温、常态及常压下，低浓度时为无色气体，当浓度达15%以上时为蓝色气体。O3不溶于液态氧，可微溶于水，0℃，一个标准大气压时，1体积水可溶入0.494体积的O3，较O2溶解度大[6]。其分子结构不稳定，在水中较空气中更容易分解。1%浓度以下的O3在常态下的半衰期是20～30m in，随温度升高，分解加速。所以，无法把O3作为一般的产品进行储存，必须现场制作现场使用。

1924年，研究人员发现氧分子含有两个不成对电子，即双自由基(⋅O-O⋅)。虽然氧分子不具有O3分子的高度活性，但其4个电子可以逐步还原成水：O2+4H+4e-=2H2O。在氧的还原反应中，随着线粒体呼吸，电子从电子传递链中被释放出来，大约3%～5%的氧生成ROS，如氢过氧自由基、超氧阴离子、H2O2和羟基自由基[1]。

O3分子也不是一个自由基分子，但它的活性要比氧活跃得多，氧化能力极强。利用外轨道带有的成对电子，在细胞内外通过生物化学反应，生成类似ROS的物质。

在血液的臭氧化过程中，O3一旦溶于血浆中，就能与多种底物，如抗氧化物质或多不饱和脂肪酸等发生反应，生成ROS和脂质氧化产物(lipid oxidation products,LOPs)。前者以H2O2最具有代表性，但半衰期短；后者半衰期相对较长，是体内氧化应激反应的主要产物[1,7]。另外，还有一种产物是还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)，反应后生成极不稳定的阴离子O3自由基，质子化后再生成羟基自由基。

2 O3氧化与缺血再灌注损伤

缺血再灌注(ischem ia reperfusion)损伤是临床器官移植及内脏疾患中常见的棘手问题。氧化应激、自由基损伤及钙离子超载等是其重要原因。作为强氧化剂，一定浓度的O3作用于心肌、肾脏及肝脏等组织，可能产生短暂的氧化应激损伤作用，但是，正确的O3预处理则是另一番结果。

2.1 心肌

国内学者将50μg/m lO31mg/kg注射于大鼠腹腔，对照组仅注射等体积的空气，每天1次，连续5 d；再制作心肌缺血30m in再灌注120m in模型，发现预处理组缺血区心肌质量占左心室质量百分比(ICS/LV)、坏死区心肌质量占缺血区心肌质量百分比(IFS/ICS)及肌钙蛋白I(cTnI)较对照组明显减少[8]。国外学者在心肌缺血再灌注前1 h，以不同浓度的O3/O2混合气体(100μg/kg、150μg/kg和300μg/kg)分别腹腔注射，对照组同样使用空气注射，再制作心肌缺血模型，结果发现干预组左心室梗死面积较对照组明显减少，且呈O3浓度依赖性；同时，干预组硝基酪氨酸、CD4、CD8、CD68、IL-6及Caspase-3较对照组均呈浓度依赖性减少，提示紧急的O3预处理可以抑制缺血心肌的炎症反应及细胞凋亡[9]。两年后，该研究组进一步发现，O3对缺血心肌的保护作用不仅与内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)表达或活性增加有关，还与募集血管内皮祖细胞(endothelialprogenitor cells,EPCs)关联[10]。以上两组研究从不同角度探讨了O3预处理对心肌缺血模型的效果，并初步阐明其可能机制。

心脏移植是缺血再灌注损伤的典型案例。一项关于大鼠心脏移植排斥反应的研究发现[11]，如果不给予任何抗排斥反应药物，移植后大鼠可生存(5.9±0.9)d，而O3预处理组(浓度50μg/ m l，剂量80mg/kg，腹腔注射)术后生存期达(7.6±1.4)d，两组差异明显，说明O3预处理有一定程度抗排斥反应效应，可以延缓大鼠术后生存期。

但是，也有研究得出不一样的结果。研究人员将一批大鼠分为4组，分别暴露于过滤后的空气及浓度为0.8 ppm O3/空气混合气体中28 d及56 d，再处死大鼠，全心缺血30min，再灌注60m in；结果发现，较之空气过滤组，O3暴露组左室形成压(left ventricular developed pressure,LVDP)明显下降，左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure,LVDEP)则明显上升，暴露56 d较28 d更为显著，且缺血心肌对O3的易感性与肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor,TNF)-α及脂质过氧化水平增加、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及白细胞介素(interleukin,IL-10)表达减少有关[12]。此研究提示直接的O3暴露有害于缺血心肌，且暴露时间越久对心肌损害越严重。

虽然上述研究皆以预处理的方式进行O3干预，但是干预途径不一样，腹腔注射O3皆有利于减轻心肌缺血再灌注损伤，而呼吸道吸入则加重心肌缺血再灌注损伤。后者与空气中O3污染对呼吸系统有害的结论一致[13]，但更重要的是提示O3污染可能会加重心脏疾患，为现代城市O3污染对冠心病患者的影响提供了理论依据。

2.2 肾脏

肾脏移植是所有内脏器官移植中存活率最高的，与其排斥反应较轻有一定关系，但其缺血再灌注损伤也不能忽视。作为“边缘”治疗手段的O3，在国内外都有较多关于O3与肾脏缺血再灌注损伤的基础研究。

与前述心肌缺血再灌注研究不同，Chen等先期研究发现，O3预处理与缺血预处理能几乎相似地减轻肾组织病理形态，降低血清肌酐及尿素氮，从而保护肾脏结构及功能[14]。但是两者联合预处理则没有叠加效应。提示O3预处理与缺血预处理可能具有相似的作用靶点。后来，其研究组制作肾脏缺氧复氧损伤模型，发现O3预处理的保护作用与促进eNOS、诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及内皮缩血管肽1表达增加有关，SOD、丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)直接参与O3介导的肾组织氧化应激保护作用[15]。

近期，X ing等通过切除右肾，夹闭左肾动脉45m in制成肾脏缺血模型，再灌注24 h，发现O3预处理组(浓度50μg/m l，剂量1mg/kg，腹腔注射)较缺血再灌注组肾组织Toll样受体4 (Toll-like receptor 4,TLR4)及核因子 κB(nuclear factor-κB, NF-κB)表达明显下降，炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-6、细胞间黏附分子(intercellularadhesionmolecule,ICAM-1)和单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)mRNA也明显减少[16]。提示O3预处理具有通过TLR4/NF-κB通路发挥潜在的抗炎效应，从而保护肾缺血再灌注损伤。

前述O3预处理皆将O3混合气体经腹腔注射或直肠吹入，而Foglieni等观察O3自血疗法在肾脏缺血再灌注的疗效。研究人员将大鼠分为对照组、假手术组、缺血组及缺血再灌注组，后三组右肾摘除，后两组夹闭左肾动脉形成缺血，再根据干预方法不同，将上述4组又分为O2自血疗法及O3自血疗法：尾静脉抽取1m l血液暴露于5m lO2或O3/O2混合物(O3/O2按1∶1体积混合，O3浓度50μg/m l)4m in，再经股动脉输回大鼠体内[17]。回输时间依次是：处死前30m in、右肾摘除后30m in、缺血前30min、缺血再灌注时[17]。结果发现，O3自血疗法能降低血清肌酐及尿素氮水平，从而保护肾组织结构与功能；但这种保护功能与血清NO表达变化没有关联，而是与血清β-NADPH脱氢酶增加有关；同时，共聚焦显微镜检测发现，O3/O2混合物处理人脐静脉内皮细胞能明显增加氧耗及线粒体活性。所以，Foglieni认为保护内皮细胞线粒体活性，减少缺血或缺血再灌注带来的内皮功能障碍，可能是O3自血疗法的保护机制之一[17]。近期，Sancak等以雄性新西兰兔作为研究对象，观察血液中性粒细胞/淋巴细胞比例、IL-6、TNF-α、缺血修饰蛋白、组织形态标记物以及氧化应激指数等指标，并赋予分值，结果发现O3自血疗法可以明显减少肾缺血再灌注后的肾间质出血及肾小管坏死，其机制可能与O3自血疗法具有抑制炎症反应及减少ROS有关[18]。

以上基础研究从肾脏功能、组织形态学及分子生物学等不同水平验证了O3对肾缺血再灌注的保护作用，尤其是O3自血疗法在大鼠及兔肾缺血再灌注的研究，为开展临床肾脏缺血再灌注O3治疗提供了理论模型。O3作为一种免疫调节剂或诱导剂应用于肾脏移植手术，也许会改善术后肾功能并提高存活率。

2.3 肝脏

相较于O3在心脏及肾脏的研究，其在肝脏缺血再灌注的文献较少。最早关于O3在肝脏缺血再灌注的报道是1999年，Peralta等通过夹闭肝动脉及门静脉形成肝右叶缺血，缺血90 m in，再灌注90m in；缺血前进行O3预处理(浓度50μg/m l，剂量1mg/kg，直肠吹入，1次/d，共10次)。结果O3处理组天冬氨酸氨基转移酶(aspartateam ino transferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanineam inotransferase,ALT)、H2O2及乳酸盐较缺血再灌注组减少，SOD及GSH较缺血再灌注组增加，组织病理学显示干预组肝细胞核及细胞质浓缩较缺血再灌注组减轻，肝细胞坏死减少[19]。所以，O3作为一种强氧化剂在肝脏缺血时，可能扮演着在内源性抗氧化及促氧化之间的平衡作用，从而减轻氧化应激反应。

肝脏缺血时，随着ATP降解，腺苷和黄嘌呤蓄积逐渐增加，前者对缺血肝脏有一定的保护作用，但随着腺苷脱氨酶的增加，腺苷逐渐被分解，其保护作用也逐渐减弱，而黄嘌呤则有触发产生ROS的毒害效应。基于腺苷及黄嘌呤的生化特性，1年后，Peralta等重新进行实验设计，结果发现O3预处理可以明显增加缺血再灌注后肝脏ATP及ADP水平，减少黄嘌呤蓄积，其机制可能与抑制黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶通路并减少ROS产生有关[20]。腺苷的释放增加在肝脏缺血预处理中发挥着重要作用，此研究从侧面反映O3预处理具有与缺血预处理相似的效果[21]。

核苷的细胞保护作用是通过调节腺苷受体实现的。氧化应激可以激活NF-κB通路从而实现对A1腺苷受体(A1adenosine receptors,A1AR)的调节。León Fernández等在上述实验设计上进行创新，加入A1AR抑制剂DPCPX(8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthin)及激活剂CCPA(2-Chloro-N6-cyclopentyladenosine)，并重新进行组合将实验分为7组，结果发现O3预处理组腺苷脱氨酶活性(adenosine deam inaseactivity,ADA)、NO及MDA表达减少，而GSH表达增加，这些指标在应用CCPA组表达进一步增加，而在应用DPCPX组被抑制[22]。同时，O3预处理组p65 (NF-κB亚基)、TNF-α及热休克蛋白(heat shock protein-70, HSP-70)表达较缺血再灌注组减少。提示激活A1AR是O3预处理发挥肝脏保护作用的关键靶点，腺苷和NO在促进细胞内氧化还原反应平衡及细胞信号通路调节中起重要作用。

最近，Gultekin等将大鼠分为3组，术前腹腔注射O3(1.2 mg/kg，1次/d，共5次)，将每组大鼠肝脏切除70%，再制作肝脏缺血再灌注模型，术后24 h及48 h检测发现，除IL-6外，O3处理组较缺血再灌注组AST、ALT、TNF-α均下降，肝脏质量、有丝分裂原指数、增殖细胞核抗原标记指数均优于对照组，提示O3不仅减轻缺血再灌注导致的肝细胞损伤，还有促进肝细胞增殖再生作用[23]。

2.4 骨骼肌

在创伤外科，止血带可能导致肢体远端的骨骼肌缺血再灌注损伤。为解决此问题，临床一般使用远端肢体低温疗法，降低代谢率，从而保护缺血骨骼肌。为对比O3与低温的效果，Ozkan等使用橡皮筋在大鼠小转子处夹闭髂总动脉2 h，再灌注22 h，低温组在再灌注初始2 h执行，O3预处理在缺血前72 h腹腔注射(浓度60μg/m l，剂量0.7mg/kg)，结果发现两组胫前肌MDA、NOX、IL-1β及iNOS表达均较缺血再灌注组减少，而SOD及GSH较缺血再灌注组增加明显，提示O3具有与低温疗法等效的抗氧化应激效应[24]。将O3预处理与高压氧预处理进行对比，两组下肢缺血再灌注后胫骨MDA和蛋白质羰基(protein carbonyl,PCO)较缺血再灌注组减少，SOD及GSH-Px增加[25]。

上述研究说明O3治疗能降低缺血骨骼肌及骨质的细胞氧化活性物质表达，在创伤急救领域具有很大潜力。

2.5 性腺

关于O3与睾丸扭转的最早报道见于2012年。研究人员将O34mg/kg提前腹腔注射，15m in后建立睾丸扭转模型，连续腹腔注射7 d，对照组使用褪黑素，结果发现，除NO外，O3与褪黑素几乎一样降低MDA表达，促进血浆抑制素B及组织GSH表达增加，改善Johnsen评分[26]。提示O3具有与褪黑素一样的抗氧化应激作用，减轻扭转所导致的睾丸缺血再灌注损伤。此外，O3的保护作用还与减少睾丸扭转后肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)、caspase-3及caspase-8表达有关[27]。

除睾丸扭转外，O3治疗卵巢扭转也有几乎同样的保护效应，如减少中性粒细胞浸润、间质水肿及组织坏死[28]。

所以，O3也许可以作为生殖器官扭转所导致的细胞变性或坏死前期的治疗手段之一。

2.6 脑

相较于以上脏器缺血再灌注研究，关于O3在脑缺血再灌注的研究非常少。Frosini等观察不同浓度O3对大鼠离体脑片氧糖剥夺及再灌注损伤的效果，结果发现120μg/m l的O3具有最理想的拮抗谷氨酸及乳酸脱氢酶释放，减轻脑片水肿的作用，且在含人血白蛋白的人工脑脊液中效应更强，提示人血白蛋白的亲和效应可能使O3的神经细胞保护作用更强。而低浓度(20～80μg/m l)和高浓度(160μg/m l)的O3干预与对照组比较则没有引起明显效应[29]。其“U”型曲线效应与O3浓度密切相关，具有典型的“毒物兴奋效应”特点[29]。2年后，师存伟等几乎复制了上述实验设计，但是，其所使用O3浓度范围是10～50μg/ m l，实验结果也符合“U”型曲线效应，最理想O3浓度为40 μg/m l[30]。虽然该O3浓度与临床实际应用浓度似乎很相近，但是在Frosini的研究中，40μg/m l的O3几乎没有神经细胞保护作用。

以上研究为O3应用于临床缺血性脑血管病的治疗提供了理论依据。但是，这两个研究均为离体研究，尚没有O3作用于脑缺血再灌注损伤的在体动物模型研究。

3 O3与缺血性脑血管病

2005年齐清燕首次报道氧透射治疗对脑梗死患者血液流变学的影响[31]，可算是国内O3治疗缺血性脑血管病的雏形。同年，《健康报》有一篇关于O3治疗脑卒中的新闻报道。直到2009年，国内才出现关于O3治疗脑梗死的正式学术文献报道[32]。近6年期间，O3在缺血性脑血管病的应用报道逐渐增多，有数十篇。方法基本都是O3融合患者自体血回输，一般抽取患者血液100m l，加入浓度(20～50)μg/m l的混合O3气体100 m l，充分氧合作用5～10m in，30m in内回输入患者体内，每天1次，共治疗5～14 d不等。在降血糖[33]、降血脂[34]、改善血液流变学[31,34]、提高临床运动功能[35]及临床治疗总有效率[36]等方面发挥着重要作用。此外，O3联合纤溶酶治疗脑梗死尚有协同降低纤维蛋白原作用[37]，而联合尼麦角林治疗则能协同提高认知功能评分，使P300潜伏期缩短[38]。另有研究发现，O3自体血回输不仅降低脑梗死患者的神经功能缺损评分，且其下降幅度与皮层运动诱发电位波幅下降幅度及中枢运动传导时间缩短呈正相关[5]。

除脑梗死急性期患者外，O3治疗脑梗死后遗症的临床疗效也有报道[39]。但是，国外关于O3在脑血管病患者的应用报道非常少。Clavo等报道1例脑膜瘤患者行O3自体血回输后，经单光子发射计算机断层成像术(Single-Photon Emission Computed Tomography,SPECT)和正电子发射断层成像术(Positron Emission Tomography,PET)检查发现脑部血流改善，代谢较治疗前增强[40]。除此外，几乎没有临床病例对照或前瞻性研究。

关于O3治疗不良反应的报道并不多见。贾红云等发现分别有2例患者在输注O3后感周身不适和乏力，减慢输液速度或调整O3浓度后症状消失[37]。而Corea等报道1例腰椎间盘突出症女性患者行椎间盘O327μg/m l注射治疗期间突发额部疼痛，双眼失明，颅脑MRI检查发现双侧枕叶皮质及皮质下、左侧丘脑及双侧额叶皮质异常信号[41]。Avcı等在给1例梅尼埃病女性患者吸入O3后突发双侧皮质盲，颅脑MRI检查发现小脑与枕叶交界区域及左侧丘脑异常信号[42]。以上两个患者的脑梗死定位具有相似性，主要位于后循环椎基底动脉系统，又称之为“Anton综合征”。所以，O3治疗存在一定的风险。

4 问题及展望

缺血再灌注损伤是临床器官移植常见问题，O3预处理可以增强机体的抗氧化能力，减轻再灌注造成的损伤，上述心、肾、肝等基础研究为O3自血疗法应用于临床奠定理论基础。但是，迄今为止，尚无O3与脑缺血再灌注损伤的在体基础研究报道，即使是离体研究也非常少。目前国内有数十篇关于O3大自血疗法应用于脑梗死急性期患者的文献报道。缺血性脑血管病急性期本身就存在缺血缺氧诱导的脑组织氧化应激损伤，O3本身具有很强的氧化特性，如果脑梗死急性期再加上1个甚至数个疗程的O3大自血处理，岂不是雪上加霜？所以，其治疗缺少理论依据，治疗效果值得怀疑。

O3治疗效果是基于小剂量O3预处理，逐渐使机体产生氧化耐受、直至产生抗氧化特性，从而保护器官缺血再灌注损伤。O3预处理具有与缺血预处理类似的效果，其无创性特点是缺血预处理不可比拟的，后者在临床上尚无法实施。如果把O3比作“补充”治疗的可选择途径，在器官移植或心脑血管病具有很大的潜在价值，但还缺少灵长类动物或临床一期的实验研究，相关机制的研究也不够深入。

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Research ProgressofOzoneOxidation and Ischem ia-reperfusion Injury(review)

TAO Xi,HUANG Liang,CAIHua-an,DENG Jing-gui
People's Hospitalof Hunan Province,Changsha,Hunan 410016,China

As an active oxygen,ozone can induce oxidative stress,how ever,small doses of ozone pretreatmentof the body may develop to oxidation toleration,even anti-oxidative damage,thereby protecting organ from ischemia-reperfusion injury.This paper reviewed the status of ozone pretreatment in organ ischem ia-reperfusion,such as heart,kidney,liver,skeletalmuscle,gonads and brain.Ozone therapy may have potential app lication values in organ transp lantsand cardiovascular diseases.Meanwhile,whether clinical app lication of ozone big autohemotherapy in ischem ic cerebrovascular disease is reasonableornot in nearly 10 yearswasput forward.

ozoneoxidation;ischem ia-reperfusion injury;ischem ic cerebrovascular disease;review

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.12.012

R364.1

A

1006-9771(2016)12-1420-05

2016-07-30

2016-09-18)

湖南省人民医院康复医学科，湖南长沙市410016。作者简介：陶希(1981-)，男，汉族，安徽枞阳县人，硕士，主治医师，主要研究方向：脑血管病康复的基础和临床。通讯作者：蔡华安，男，硕士，主任医师，主要研究方向：神经康复。E-mail:623124733@qq.com。