凋亡抑制蛋白抑制剂治疗慢性乙型肝炎应用的研究进展

谷世寅，仲云熙，金孝亮，彭 英，王广基，孙建国

（中国药科大学药物代谢动力学重点实验室，江苏 南京 210009）

凋亡抑制蛋白抑制剂治疗慢性乙型肝炎应用的研究进展

谷世寅，仲云熙，金孝亮，彭 英，王广基，孙建国

（中国药科大学药物代谢动力学重点实验室，江苏 南京 210009）

乙型肝炎病毒（HBV）在机体内的持续复制增殖以及机体自身免疫系统的异常是引起乙肝慢性化的2个主要因素。以往治疗慢性乙肝（CHB）药物的机制主要包括直接抑制HBV-DNA复制，如恩替卡韦和阿德福韦酯等；诱导细胞抗病毒蛋白的产生，如干扰素-α等；免疫调节，如干扰素-α、免疫增强剂和免疫抑制剂等。然而上述治疗方法并不能治愈CHB。凋亡抑制蛋白（IAP）是一种重要的细胞凋亡调节因子，IAP抑制剂被证实可用于抗肿瘤治疗。近期有实验表明，IAP家族中的一类，细胞凋亡抑制蛋白（cIAP），其抑制剂在治疗CHB中能发挥很好的疗效，其机制可能是cIAP抑制剂能通过促进感染HBV的肝细胞凋亡而起到清除体内HBV的作用。与以往用于CHB治疗的药物抑制HBV-DNA的复制不同，cIAP抑制剂能将机体中的HBV清除，降低体内HBV载量，有望治愈CHB，改善患者的预后。cIAP抑制剂有望成为一种新型有效的治疗CHB的药物。

慢性乙型肝炎；乙型肝炎病毒；凋亡抑制蛋白

根据乙型肝炎的病程可分为一过性病毒血症、自愈性急性肝炎、无症状慢性病毒携带状态、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）、进行性肝损害及肝硬化或肝癌［1］。CHB由于存在乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）的免疫逃逸机制等难以治愈。目前，最有效的防治方法是对婴幼儿进行乙型肝炎疫苗的接种。国际广泛认可的治疗CHB的药物主要有2类，一为干扰素类，一为核苷类似物。但由于它们均无法完全清除细胞内的HBV，且易产生耐药，因此人们致力于发现新的治疗CHB的方法，以期能彻底清除HBV，达到治愈CHB的目的。早期被用于治疗实体瘤的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）抑制剂，近年来被发现其中细胞凋亡抑制蛋白（cellular IAP，cIAP）抑制剂对HBV具有清除作用，为彻底清除HBV提供了一个新的途径并为CHB治疗药物的设计提供了一条新的思路。本文就CHB的发病机制、药物治疗机制及cIAP抑制剂在治疗CHB方面的机制与优势等几个方面进行综述。

1 CHB的发病机制

HBV自身对肝细胞不会产生直接的细胞毒性，而是通过HBV在体内不断复制并激活免疫应答反应诱发肝的免疫病理损伤。相关研究表明，约60% HBV感染者存在HBV的大量复制和肝的慢性炎性损伤。目前认为，乙肝慢性化机制存在两个方面因素的影响，一方面是HBV的持续复制；另一方面是机体免疫清除异常，它们相互作用，导致了CHB的发生与发展。

1.1 病毒因素

与HBV相关的慢性化的病毒因素主要包括3个：①HBV在自然复制的过程中易发生突变反应，且在治疗过程中也易诱导HBV发生突变反应，从而能逃逸机体免疫系统的清除效应，另外由于HBV-DNA的复制水平较低，机体难以对其彻底清除［2-3］；②HBV-DNA能够与机体受感染的肝细胞DNA整合，在机体肝细胞中形成共价闭合环状DNA，作为HBV转录的模板，长期维持HBV慢性感染；③HBV在复制过程中对机体的免疫细胞能产生影响，降低机体免疫细胞活性，从而影响机体清除HBV的效果［4-5］。

1.2 机体因素

导致乙肝慢性化的机体因素主要与机体的免疫系统有关。一种原因是由于机体免疫系统尚未成熟导致免疫耐受的产生［6］。相关研究表明，我国约40%乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）携带者均由母婴垂直传播导致，由于胎儿的免疫系统正处于发育阶段，此时若机体感染HBV，体内缺乏可对HBV产生应答的T细胞，会导致中枢性免疫耐受的产生，而这种耐受很难消除。对于新生儿而言，由于其免疫系统尚未完全发育成熟，此时感染HBV则会出现周围T细胞的免疫耐受。机体的免疫系统随年龄增长逐渐成熟，发生免疫耐受的可能性越来越低。对于正常成年人而言，由于免疫系统已完备，无免疫缺损，此时感染HBV后往往会自愈，仅约10%患者会转化为CHB。另一原因是特异性免疫应答能力低下、免疫调节功能异常以及自身免疫反应的异常参与等，均会导致机体感染HBV后的慢性化［7］。

2 经典药物治疗CHB的作用机制

目前，临床上治疗CHB药物的作用机制包括直接抑制HBV-DNA复制、诱导细胞抗病毒蛋白产生及免疫调节等。

2.1 直接抑制HBV-DNA复制

基于该机制进行疾病治疗的药物主要分为2类，一类是核苷衍生物类抗HBV药物；另一类是嘌呤衍生物类抗HBV药物。2种药物的作用机制相似，均是通过竞争性地抑制HBV-DNA的合成过程而抑制HBV的复制，降低HBV在机体内的含量。核苷衍生物类抗HBV药物包括拉米夫定（lamivudine）、泛昔洛韦（famciclovir）、罗布卡伟（labucavir）和恩替卡韦（entecavir）等。如恩替卡韦是一个前药，其在体内能代谢转化生成具有生物活性的三磷酸盐，活化的恩替卡韦能通过与HBV聚合酶的底物三磷酸脱氧鸟嘌呤竞争而参与到HBV-DNA的复制过程中，从而抑制HBV的复制［8］。该类药物虽能改善患者的临床症状，但HBVDNA的转阴效果并不理想，且易产生耐药性。嘌呤衍生物类抗HBV药物包括阿德福韦酯（adefovir dipivoxil）和氧硫胞嘧啶（或称思曲他滨，emtricitabine）等，其也是通过竞争HBV聚合酶而参与到HBVDNA的合成中，通过终止HBV-DNA链的合成，发挥抗HBV的效果。

2.2 诱导细胞抗病毒蛋白的产生

目前，干扰素α（interferon-α，IFN-α）在多个国家被批准用于CHB的治疗。IFN-α能与特定的细胞表面受体结合，诱导产生多种抗病毒蛋白，包括蛋白激酶、2′-5′-寡腺苷酸合成酶、腺苷脱氨酶和Mx蛋白等。不同的抗病毒蛋白作用不同，蛋白激酶能促进病毒RNA的翻译起始因子磷酸化失活，抑制病毒mRNA的翻译从而阻碍病毒蛋白的合成；2′-5′-寡腺苷酸合成酶能激活机体内的RNA酶L，促进病毒RNA的降解；腺苷脱氨酶能作用于病毒双链RNA，促进病毒双链RNA的解聚失活；Mx蛋白能作用于细胞中病毒核壳体的转运与RNA的合成。近年来的研究发现，IFN-α诱导产生的转录因子p48能作用于HBV基因组增强子，从而抑制其生物活性，达到抑制HBV复制的目的［9-10］。另外还有研究发现，IFN-α还能诱导表达髓系分化蛋白而抑制HBV-DNA的复制［11］。

2.3 免疫调节

IFN-α不仅能发挥直接抗病毒作用，还能诱导与促进受感染细胞生成一组抗原提呈相关基因编码的酶，这些酶能对病毒蛋白进行加工并促进病毒蛋白与人类白细胞抗原相结合，促进受感染的细胞被CD8+T细胞毒淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）所识别并清除。相关研究已经证实，患者在使用IFN-α治疗后，肝内CD8+CTL的数量显著性增加［12］。同时，IFN-α也能促进CD14±单核细胞分化为树突状细胞。临床研究已证实，患者经IFN-α治疗后，组织中树突细胞的数量显著性增加。另外，IFN-α还能通过STAT1通路活化自然杀伤细胞（natural killer，NK），促进对靶细胞的裂解作用［13］。

除IFN-α外，还有一些免疫调节药物能阻止或控制CHB的发展进程［14］，包括免疫增强剂（胸腺肽α和左旋咪唑等）、免疫抑制剂（秋水仙碱和和糖皮质激素等）、重组细胞因子（粒-巨噬细胞集落剌激因子和白细胞介素2等）和其他免疫调节药物（乙肝免疫球蛋白、特异性免疫核糖核酸和转移因子等）［15-18］。

3 IAP基本分类及临床应用

IAP是机体中一类重要的细胞凋亡因子，其结构中必需的蛋白区域有杆状病毒IAP重复序列（bacuiovirus IAP repeats，BIR）结构域、指环(really interesting new gene，RING）结构域与胱天蛋白酶激活和招募域（caspase activation andrecruitment domain，CARD）等结构域。其中BIR结构域最为重要，其由1～3个长约70个氨基酸的杆状病毒IAP重复序列组成，IAP能通过BIR与多种细胞因子结合，发挥多种生物活性，包括由死亡受体介导的外源性细胞凋亡途径以及由细胞色素c介导的内源性细胞凋亡途径。另外，对化疗药物诱发的细胞凋亡也有一定的抑制作用。

IAP是一类蛋白质家族，其对应的抗凋亡基因家族是高度保守的。目前，在人体中发现的IAP包括cIAP-1，cIAP-2，x染色体相关IAP（X chromo⁃some-linked IAP，XIAP），黑素细胞IAP（melano⁃cytes IAP，ML-IAP），存活素（survivin），活素蛋白（livin），ILP-2/Ts-IAP，NAIP和BRUCE/apollon等。

3.1 IAP的基本分类

3.1.1 cIAP-1与cIAP-2

cIAP-1与cIAP-2均是人类内源性抗凋亡蛋白，两者均参与膜蛋白肿瘤坏死因子受体2（tumor necrosis factor receptor 2，TNFR2）复合体的形成。TNFR相关因子（tumor necrosis factor-recep⁃tor associated factor，TRAF）1和TRAF2能与TNFR2结合并激活NF-κB，增强IAP的表达，从而抑制细胞凋亡。相关实验已证明，cIAP-1能抑制胱天蛋白酶3，7和9等的活性，从而达到抑制细胞凋亡的作用；而脂多糖能提高cIAP-2的活性并抑制凋亡。cIAP-1主要表达于肝、肾和小肠中，在神经组织中也有少量表达；cIAP-2主要表达于胸腺和脾中，并在人体免疫调节中发挥着重要的作用［19］。

3.1.2 XIAP

XIAP能抑制胱天蛋白酶3，7和9前体，达到抑制细胞凋亡的目的；而XIAP对胱天蛋白酶1，6，8和10无直接抑制作用。相关实验表明，在肿瘤细胞中，通过干扰或敲除XIAP基因，能明显增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［20］。

3.1.3 ML-IAP

ML-IAP能抑制胱天蛋白酶3和9，而对胱天蛋白酶7无抑制作用。ML-IAP对胱天蛋白酶9的抑制作用提示，ML-IAP能抑制内源性细胞凋亡通路［21］，但不能抑制外源性细胞凋亡通路。相关研究表明，ML-IAP在多种肿瘤细胞以及胚胎组织中均大量表达。相关实验研究了正常的黑素细胞与黑色素细胞瘤中ML-IAP的表达差异，表明ML-IAP仅在黑素细胞瘤中表达。另外，ML-IAP高表达的黑素瘤细胞也具有很强的抗凋亡能力。因此，ML-IAP在黑素细胞瘤的发生发展过程中扮演重要的角色［22］。

3.1.4 存活素

存活素是近年来在哺乳动物肿瘤细胞中发现的一类IAP。存活素在几乎全部的肿瘤细胞中均高度表达，在胎儿的大脑组织中也高度表达，但在正常成人组织中并不见表达［23-24］。反义DNA能抑制内源性存活素的表达，抑制存活素与微管的相互作用，从而能阻抑存活素抗细胞凋亡活性并增强胱天蛋白酶活性，引起有丝分裂期细胞的死亡［25］。相关研究表明，存活素和XIAP在IAP家族中具有最强的抗凋亡作用。

3.1.5 活素蛋白

活素蛋白的作用机制与存活素类似。在肿瘤细胞与胎盘组织中均能发现活素蛋白的高度表达，而在成人正常组织中并无表达。与其他IAP相同，活素蛋白通过其BIR区域与不同的细胞因子结合发挥抗细胞凋亡的作用，从而抑制内源性与外源性细胞凋亡通路［26-27］。

3.2 IAP可能的作用机制

IAP通过与TRAF结合形成TNFR信号复合体，干扰TNF激活的死亡信号，从而抑制由死亡受体TNF引起的凋亡。IAP能通过抑制胱天蛋白酶蛋白而抑制内源性与外源性细胞凋亡通路，主要包括胱天蛋白酶3，7和9前体或活性结构。由于对胱天蛋白酶的直接抑制也能产生相同的生物学活性，因此IAP的确切作用机制还有待进一步深入研究。

3.3 IAP的临床应用

IAP对肿瘤的发生发展具有重要的作用，能作为多种肿瘤的诊断与预后的指标。相关研究表明，在恶性黑素瘤、转移性黑素瘤、皮肤黑痣和发育不良痣肿瘤细胞的细胞质中均发现了存活素的表达，而在黑素瘤的细胞核中也发现了存活素的表达，因此通过检测肿瘤细胞核中存活素的表达能区分出黑素瘤。另外，相关研究表明，肿瘤细胞中表达存活素的患者术后复发率与死亡率均显著增加，表明存活素能作为评价肿瘤预后的一个重要指标［28］。肿瘤的发生发展与机体生长信号及凋亡通路的异常均有密切的相关性。IAP家族蛋白能促进肿瘤细胞凋亡逃逸［29］。目前正在研究的IAP抑制剂反义寡核苷酸能显著性抑制动物模型上肿瘤细胞的生长［30］。

4 IAP抑制剂的分类、作用机制和临床应用

4.1 IAP抑制剂的基本分类

4.1.1 反义寡核苷酸

相关研究表明，反义寡核苷酸能抑制IAP的表达，从而促进细胞发生凋亡。另外，反义寡核苷酸还能提高肿瘤细胞对化疗药物与放疗的敏感性，提高治疗效果［31-32］。目前，已有相关反义核苷酸类药物进行临床试验，有望成为新型的用于治疗CHB的药物。

4.1.2 小分子抑制剂

小分子抑制剂包括内源性IAP抑制剂和BIR抑制剂。①内源性IAP抑制剂。在正常机体中存在一些蛋白质如第二线粒体源的胱天蛋白酶激活物（second mitochondrial activator of caspases，SMAC）等，能抑制IAP的活性。SMAC是一种游离的线粒体蛋白质，当线粒体凋亡程序被激活或其功能发生紊乱时，SMAC会从线粒体中游离出来并在细胞内发生裂解，形成的活性蛋白能与IAP结合并抑制其活性［29］。目前一些人工合成的具有IAP活性抑制作用的化合物即为SMAC的结构类似物，通过与IAP的结合抑制后者与胱天蛋白酶结合，从而促进细胞凋亡。②BIR抑制剂。BIR抑制剂是一类能与IAP中的BIR蛋白域相结合的SMAC类似物。比立那帕（birinapant）即是人工合成的一个BIR抑制剂，它能与IAP中的BIR3区域相结合，产生抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、提高肿瘤细胞对化疗药物与放疗敏感性的作用［33-35］。

4.2 IAP抑制剂的作用机制

IAP抑制剂基本均为SMAC类似物，其作用机制主要是直接促进凋亡蛋白酶的释放而无需以线粒体功能紊乱为前提诱导SMAC释放，并在细胞质中与IAP结合抑制其抗凋亡活性。因此，SMAC小分子类似物可与其他抗癌药物共同作用，起到协同作用。近期研究表明，对于非小细胞性肺癌细胞，细胞自分泌TNF-α通路可被SMAC类似物开启，激活RIPK1依赖的胱天蛋白酶8激活复合物，从而诱导细胞凋亡［29］。

4.3 IAP抑制剂的临床应用

IAP抑制剂能用于肿瘤疾病的辅助治疗。IAP抑制剂一方面能抑制肿瘤细胞的凋亡异常，另一方面与其他抗肿瘤药联合使用能提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，提高药物疗效。目前已有部分IAP抑制剂类药物进入临床试验［36-38］。近期有研究表明，cIAP抑制剂在治疗CHB中也能发挥很好的疗效，其机制可能是cIAP抑制剂能够通过促进感染HBV的肝细胞的凋亡而起到清除体内HBV的作用［39-40］。与以往用于CHB治疗的药物仅能抑制HBV-DNA的复制不同，cIAP抑制剂能直接将机体中的HBV清除，有望治愈CHB，改善患者的预后。

5 IAP抑制剂在治疗CHB方面的应用

较之目前临床上应用的治疗CHB的药物，cIAP抑制剂的优势在于不仅能有效抑制病毒复制，同时还能促进感染HBV的肝细胞凋亡，主动清除机体内的HBV。相关文献表明，cIAP抑制剂通过作用于TNF介导的死亡通路，促进感染HBV的肝细胞凋亡而达到清除HBV的目的［39］。相关研究表明，对于血清中能检测到HBsAg的HBV感染患者，使用TNF拮抗剂治疗会增加其复发的概率。这一研究结果与以往认为TNF能清除HBV的观点不一致［41-42］。cIAP能促进NF-κB活性，进而抑制TNF与TNFR1的结合，减少了由TNF介导的细胞凋亡，提高了细胞生存率。动物实验表明，当给予cIAP抑制剂后，TNF与TN⁃FR1的结合增加，从而增加了TNF介导的细胞凋亡，达到清除HBV的作用［43-44］。因此，cIAP可能用作治疗CHB的靶点［39］。

5.1 cIAP抑制剂清除HBV的作用机制

TNF的生物活性包括抗病毒、促细胞程序性死亡、激活NF-κB和宿主防御等。TNF的生物活性通过TNFR介导，且其中的TNFR1发挥主要的作用。在TNFR1中最为重要的蛋白域为TNFR1相关死亡域蛋白（TNFR1-associated death domain pro⁃tein，TRADD），TNF与蛋白域TRADD结合后发挥促细胞凋亡与激活NF-κB的生物活性［45］。HBV感染的模型小鼠血浆中TNF水平升高，肝部位TNFR1表达增加，可能会诱导NF-κB通路，NF-κB信号通路的激活会加快肝细胞的周期进程，可能是促进肿瘤细胞发生发展的重要机制。大量研究表明，cIAP可促进TNFR下游NF-κB通路的激活，干扰cIAP的功能会导致TNFR下游细胞凋亡通路和其他死亡受体的激活［46-49］。而从cIAP-1和cIAP-2缺失的小鼠慢性HBV感染模型可见，cIAP缺失可通过TNF介导导致乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）表达肝细胞的死亡［40］。

5.2 SMAC类似物比立那帕

5.2.1 比立那帕作用机制

肿瘤细胞凋亡的异常与IAP的调节失常存在密切关系。正常情况下机体中的内源性IAP抑制剂对IAP进行调控，如SMAC中的N端四肽能与IAP中的蛋白域BIR结合，从而抑制IAP的活性。而比立那帕是一种SMAC的结构类似物，能通过与IAP结构中的蛋白域BIR3结合，发挥与SMAC类似的作用。相关研究表明，比立那帕能在婴儿体内诱导cIAP-1与cIAP-2的凋亡，从而抑制TNF介导的NF-κB的激活［50］。

5.2.2 比立那帕对HBV的作用

比立那帕，包括其他SMAC类似物，均能发挥抑制IAP的作用。相关研究表明，比立那帕等药物能够促进机体血清中HBV-DNA的清除。在C57BL/6小鼠模型中，比立那帕对细胞具有一定的选择性作用，能够清除机体中表达HBsAg和HBcAg的肝细胞，并降低肝中HBV-DNA的载量［39］。在CD4+T细胞数量高的小鼠体内，比立那帕对HBV的作用减弱。比立那帕在慢性HBV患者体内的作用效果也与HBV特异性CD4+T细胞数量和活性有关。此外，比立那帕与恩替卡韦等抗肿瘤药联合使用能增强恩替卡韦等药物的药效［51-54］。

6 IAP抑制剂的副作用

目前临床研究中IAP抑制剂出现的不良反应相对较少。相关研究报道，HGS1029作为治疗实体瘤的IAP抑制剂在临床上出现严重的过敏反应和胰酶水平升高症状［55］。部分二价IAP抑制剂也被报道有淋巴细胞减少、皮疹等轻微的不良反应［38，55］。比立那帕Ⅰ期临床试验中部分患者出现面神经麻痹的不良反应。IAP抑制剂在临床使用中可能存在的不良反应需要进一步观察。

综上所述，以往用于治疗CHB的药物主要为干扰素类与核苷类似物，它们虽对CHB具有治疗作用，并在一定程度上控制疾病进程，但由于不能有效杀灭HBV，因此不能达到治愈CHB的目的。cIAP抑制剂能作用于cIAP，从而激活TNFR及其他死亡受体，继而激活下游细胞凋亡通路，增强抗病毒活性、激活转录因子NF-κB、增强宿主防御及激活细胞的程序性死亡，促进HBV感染的肝细胞凋亡，达到治疗疾病的效果。上述研究为临床使用cIAP抑制剂治疗CHB提供了理论基础，也为临床深入研究cIAP抑制剂治疗HBV的效果与药物联用提供了思路与方法。

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Treatment of chronic hepatitis B by cellular inhibitor of apoptosis protein inhibitors：research progress

GU Shi-yin，ZHONG Yun-xi，JIN Xiao-liang，PENG Ying，WANG Guang-ji，SUN Jian-guo
（Key Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics，State Key Laboratory of Natural Medicines，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Chronic hepatitis B（CHB）is related to the continuous replication of hepatitis B viruses（HBV）and the abnormal function of immune systems.Acceptable therapies of CHB include direct inhi⁃bition of HBV-DNA replication by entecavir or adefovir dipivoxil，induction of cellular anti-virus protein production and regulation of immune function by interferons，immunoenhancers or immunosuppressors. Those classical therapeutic drugs cannot cure CHB.The inhibitor of apoptosis proteins（IAP），as an important apoptosis regulatory factor，can be inhibited to result in anti-tumor efficacy.Recent experi⁃ments indicated that IAP inhibitors show good therapeutic effiect in CHB.IAP inhibitors can stimulate the apoptosis of cells infected with HBV to clear HBV in CHB patients.Unlike previous prevention of HBVDNA replication only，clearance of HBV by IAP inhibitors is a promising mechanism to cure CHB instead of controlling the development of CHB alone.Therefore，it is hoped cIAP inhibitors may be effective for CHB.

chronic hepatitis B；hepatitis B virus；inhibitor of apoptosis protein

s：WANG Guang-ji，E-mail：guangjiwang@hotmail.com，Tel：（025）83271128；SUN Jian-guo，E-mail：jgsun@cpu.edu.cn，Tel：（025）83271176

R978.7

A

1000-3002-（2016）11-1211-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.11.013

Foundation item：The project supported by Jiangsu Unversity Advantage Disciplines Construction Engineering Project；and Key Research Project in Key Lab of Drug Metabolism and Pharmacokinetics of Jiangsu Province

2016-03-31 接受日期：2016-11-01）

（本文编辑：齐春会）

江苏高校优势学科建设工程资助项目；江苏省药物代谢动力学研究重点实验室项目

谷世寅，硕士研究生，主要从事药物代谢动力学研究，E-mail：gsy.163@163.com

王广基，E-mail：guangjiwang@hotmail.com，Tel：（025）83271128；孙建国，E-mail：jgsun@cpu.edu.cn，Tel：（025）83271176