决明子水提物对大鼠尿液内源性代谢产物的影响

许龙龙，汤响林，梁乾德，李 杰，王宇光，马增春，肖成荣，谭洪玲，高 月

（1.安徽医科大学研究生学院，安徽合肥 230032；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850）

决明子水提物对大鼠尿液内源性代谢产物的影响

许龙龙1，2，汤响林2，梁乾德2，李 杰2，王宇光2，马增春2，肖成荣2，谭洪玲2，高 月1，2

（1.安徽医科大学研究生学院，安徽合肥 230032；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850）

目的 基于代谢组学的方法研究决明子水提物（AESC）对大鼠尿液内源性代谢产物的影响。方法 雄性SD大鼠28只随机分成正常对照组、AESC 1.5，5和15 g·kg-1剂量组，每组7只，连续给药14 d，正常对照组给予生理盐水，末次给药后收集24 h尿液。应用超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱（UPLCQ-TOF-MS）分析尿液，MassLynx V4.1软件采集并处理数据，采用主成分分析（PCA）方法和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）方法，分析各组大鼠内源性代谢产物的差别，通过正交偏最小二乘法（OPLS-DA）、变量重要程度（VIP）和t检验筛选潜在生物标志物并测定其相对含量。结果 PCA结果显示，组内样本点较好地聚合在一起，各AESC给药组与正常对照组互相完全分离，且与正常对照组之间的距离随着AESC给药剂量的增加而增大；与正常对照组脯氨酸甜菜碱和尿酸的相对含量25.0±3.4和29.0±4.8相比，AESC 5和15 g·kg-1组明显降低（P＜0.01），分别为18.4±2.3，15.7±2.0和16.3±4.5，14.7±3.0；AESC 1.5，5和15 g·kg-1组甘氨酸和牛磺酸的相对含量明显低于正常对照组（P＜0.05，P＜0.01）；AESC 1.5和15 g·kg-1组二甲基鸟苷、15 g·kg-1组柠檬酸的相对含量均明显低于正常对照组（P＜0.05，P＜0.01）；AESC 1.5 g·kg-1组柠檬酸的相对含量为104±20，明显高于正常对照组67±14（P＜0.01）。结论 AESC给药14 d后，大鼠尿液中内源性物质有显著改变，它们对体内代谢的影响可能主要集中于牛磺酸代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢和能量代谢途径。

决明子；代谢组学；生物标志物；尿液

决明子（Semen Cassiae）为豆科植物决明（Cassia obtusifoliaL.）或小决明（C.toraL.）的干燥成熟种子，主产于安徽、广西和四川等地，其主要成分为蒽醌类和萘并吡喃酮类化合物，具有降血压、降血脂和保肝等多种药理活性，临床上主要用于高脂血症、高血压和便秘等，是国家卫计委公布的100多种药食同源物品之一［1-2］。近年来，国内外学者的研究主要集中在对决明子的化学成分、药理作用及临床应用等方面，Yang等［3］利用超高效液相色谱串联质谱技术研究大鼠ig决明子提取物后，血浆中主要有效化学成分为黄决明素、橙黄决明素、芦荟大黄素和大黄素等蒽醌类物质；Kim等［4］研究发现，决明子提取物通过抑制高级聚糖化终产物的堆积，可改善大鼠由链脲霉素诱导的糖尿病性肾病（diabetic nephropathy，DN）；刘利兵等［5］研究表明，决明子提取物可能通过降脂并激活蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）及细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK1/2）信号，有效减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤；对于决明子的药效成分研究主要集中在蒽醌类化合物上，但其药效成分和作用机制并不十分清楚，尚待深入研究。

代谢组学是近年来发展起来的一门新兴“组学”技术，主要是通过核磁共振、质谱联用等现代分析技术测定生物样品如尿液、血液和胆汁中相对分子质量＜1000的内源性物质［6］。它是针对内源性代谢产物的高通量、定性和定量测定技术，是通过外界刺激后分析生物体内相对分子质量较低代谢物的全面变化，来认识生物体的生理和病理状态。代谢组学研究思路上的整体性和动态性，与中医药理论的整体观念是相一致的。因此，运用代谢组学研究中药，有助于从整体上完整地了解中医药的作用机制。

近代研究中，代谢组学已广泛应用于中药成分及中药作用机制的研究［7］，而决明子对体内内源性代谢物的变化研究尚未见报道。高分辨率的四极杆飞行时间质谱（quadrupole-time-of-flight mass spectrometry，Q-TOF/MS）在进行物质定性分析时可提供较为可靠的多种结构相关信息，具有高分离效率、高灵敏度及极低检测限等优势，故本文采用高效液相色谱（ultra-performance liquid chroma⁃tography，UPLC）-Q-TOF/MS技术，探讨正常大鼠、决明子水提物（aqueous extract of Semen Cassiae，AESC）给药后大鼠的尿液成分谱变化，结合模式识别方法分类，快速寻找生物标志物，并进一步对目标物进行串联质谱分析确定大鼠尿液内源性物质，通过结合大鼠物质和能量代谢的代谢通路和代谢网络［8-9］，进一步阐释决明子对正常大鼠尿液的干预机制，为决明子的临床应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 药材和样品制备

决明子（购于北京同仁堂，产地安徽，批号20150201），经鉴定为豆科植物决明（C.obtusifoliaL.）的干燥成熟种子。AESC（批号20150320）由本实验室提取制备：取决明子500 g，置圆底烧瓶中，加入8倍量蒸馏水浸没药材，浸泡30min后，加热至煮沸，保持微沸60 min，分离煎出液，药渣加入4倍量蒸馏水依法再次煎煮30 min，合并2次煎出液，置50℃水浴锅中缓慢蒸发，浓缩至500 mL（按生药算，相当于1 kg·L-1），于4℃保存备用。

1.2 主要仪器和试剂

ACQUITY UPLC/SYNAPT QTOF-MS液质联用仪和ACQUITY UPLC®HSS T3（1.8 μm，2.1 mm× 100 mm）Column均为美国 Waters公司产品；-80℃超低温冰箱（美国Thermo Scientific公司）；Microfuge®22R Centrifuge（美国Beckman公司）；纯水仪（Millipore Simplicity）；亮氨酸脑啡肽（美国Sigma公司）；甲醇（HPLC级）和乙腈（HPLC级）、均为美国Fisher Scientific公司；甲酸（HPLC级）为美国MREDA公司。

1.3 动物和分组

雄性SD大鼠，SPF级，体质量180～220 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SYXK（军）2015-004，实验动物合格证号：SCXK（军）2015-004。动物随机分为4组，每组7只，分别为正常对照组，AESC 1.5，5和15 g·kg-1剂量组。

1.4 实验方法

正常对照组给予生理盐水，连续灌胃14 d；AESC每天1.5 g·kg-1（根据《中国药典》，由人临床剂量换算成大鼠等效剂量），AESC 5 g·kg-1（相当于3倍人临床剂量），AESC 15 g·kg-1（相当于9倍人临床剂量），每天ig给药1次，连续14 d。最后一次给药后，将大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液，3000×g离心10 min，分别取1 mL上清液于1.5 mL EP管中，加入20 μL叠氮钠，于-80℃冰箱中保存。

1.5 样品预处理和质控样品的制备

实验前，取出样品常温下解冻。各取500 μL解冻后的样本，加入500 μL的乙腈，涡旋混匀，静置1 min，4℃下13 000×g离心15 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜滤过后进样。本实验将尿液样本进行混合制得质控（quality control，QC）样本，通过连续5针进样平衡系统，保证系统的适应性。另外，QC作为实际样本插入检测序列中，以QC数据的PCA得分图监测方法的稳定性。

1.6 色谱和质谱条件

色谱条件采用Waters Acquity UPLC®HSS T3色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），柱温30℃；二元溶剂系统：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件：0～2 min，98%～95%A；2～13 min，95%～50%A；13～16 min，50%～0%A；16～20 min，0%～98%A；流速为0.5 mL·min-1；进样量为5 μL。质谱条件：电喷雾电离源，离子源温度100℃，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气（N2）流速900 L·h-1。在负离子电离模式下，毛细管电离电压2.9 kV；在正离子电离模式下，毛细管电离电压3.0 kV；取样锥孔电压40 V。质量扫描范围m/z50～1000，一次扫描时间为0.1 s。在二级质谱模式下，碰撞能量在10～30 eV之间。TOF离子飞行方式采用V模式，使用亮脑啡肽作为外标对目标离子进行精确质量测定。

1.7 数据处理

数据通过采用MassLynx V4.1软件（Waters公司）进行处理。采用主成分分析法（principal component analysis，PCA）观察样品的聚集、离散及离群点，通过正交偏最小二乘判别分析法（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）的得分图（scores plot，s-plot）可观察到正常对照组与各给药组尿液成分的分布情况及差异，选择变量重要程度（variable impor⁃tance in the projection，VIP）＞1的变量进行t检验，在95%的置信度下，正常对照组与给药组具有显著性差异（P＜0.05）的变量为有效信号。

1.8 标志物的鉴别

将得到的有效信号与实验室自建数据库（梁乾德博士建立）匹配，过滤除去外源性物质的干扰，在HMDB、KEGG等谱库中检索鉴别这些化合物的结构，通过二级质谱和标准品进行确证。

1.9 统计学分析

实验结果数据用x±s表示，SPSS 17.0软件进行one-way ANOVA比较组间差异。

2 结果

2.1 决明子水提物指纹图谱及主要成分鉴定

如图1中所示，A和B分别为AESC正、负离子模式下的基峰离子流色谱图（base peak intensity chromatograms，BPI），C，D，E和F分别为4种主要活性成分标准品的基峰离子流图，它们分别为黄决明素（chrysoobtusin）、橙黄决明素（aurantioobtusin）、芦荟大黄素（aloeemodin）和大黄素（emodin）；通过与标准品比对保留时间和质荷比，发现AESC中主要含有黄决明素和橙黄决明素。

2.2 给AESC后大鼠尿UPLC-Q-TOF-MS代谢指纹图谱

采用UPLC-MS进行尿液样品的分离和数据采集，图2分别为大鼠尿液样品正、负离子模式下的BPI。由图可看见AESC给药组与正常对照组比较其代谢指纹图谱均表现出一定的差异，各给药组之间也表现出一定的差异性，如给药组与正常对照组相比，明显出现了正、负离子模式质荷比为331和329的峰，推测为橙黄决明素；各给药组之间，在负离子模式下，AESC 15与5 g·kg-1组分别出现质荷比为230和438的不同峰型，但经质谱分析确定为同一物质。

2.3 方法学验证

QC样品用于检测UPLC-Q-TOF/MS的重复性和稳定性。图3所示，正、负离子模式下的QC样品聚成一团，分别选择正、负离子模式5个离子，对它们的保留时间和峰面积进行分析，正、负离子模式下保留时间的相对标准偏差分别为0.00%～0.58%和0.00%～0.23%，峰面积相对标准偏差分别为6.05%～7.37%和2.58%～4.63%，表明本实验方法重复性和稳定性良好，可用于实验。

2.4 AESC对大鼠尿内源性代谢产物影响的组学分析

如图4所示，UPLC-MS数据进行PCA分析，得出反映各组内样品的聚集、离散及离群点PCA图。由图可见，各组样本点较好地聚合在一起，AESC 1.5，5和15 g·kg-1组样本点均与正常对照组样本点完全分离，两者样本点的距离随给药浓度的增加而增大，偏离程度更加明显，说明AESC给药后大鼠尿液中内源性物质的代谢发生明显的变化，且呈剂量依赖性，同时正常对照组与AESC 1.5 g·kg-1组样品出现离群点，说明部分样本分布较为分散，组内差异较大。

Fig.1 Base peak intensity chromatograms（BPI）of aqueous extract of semen cassiae（AESC）and its standards of major components by electrospray ionization in positive mode（ES＋）or negative ion（ES－）.A：AESC in ES＋；B：AESC in ES－；C：chryso-obtusin in ES＋；D：aurantio-obtusin in ES－；E：aloeemodin in ES－；F：emodin in ES－.

Fig.2 BPI in ES+（A）and ES-（B）ion mode based on urine metabolic profiling of normal control group（a），AESC 1.5（b），5（c）and 15 g·kg-1（d）groups after rats were ig administered with AESC for 14 d.

Fig.3 Principal component analysis（PCA）score plots of quality control（QC）samples in ES＋（A）and ES－（B）.○：normal control group；●：AESC 1.5 g·kg-1group；△：AESC 5 g·kg-1group；▲：AESC 15 g·kg-1group；□：QC samples.

Fig.4 PCA scores plots in ES＋（A）and ES－（B）based on urine metabolic profiling.Normal control group（○），AESC 1.5 g·kg-1group（●），AESC 5 g·kg-1group（△）and AESC 15 g·kg-1group（▲）after rats were ig given AESC for 14 d.

选取AESC 15 g·kg-1组和正常对照组进行OPLS-DA分析比较，确定主要差异性变量。两组的OPLS-DA s-plot及VIP见图5，每个点代表一个变量，s-plot图横坐标代表变量的贡献度（协方差），纵坐标代表变量的相关性（可信度），取值在-1到+1之间。s-plot图中离原点越远的点，表示其差异性越明显；VIP值越高，表示该变量对模型的贡献度越高。

2.5 潜在标志物鉴别

为了进一步分析标志物，通过将VIP＞1及P＜0.05的化合物筛选出来作为差异性化合物。根据变量对应的质荷比、保留时间及质谱图，利用标准品及二级质谱信息进行结构鉴定，共鉴定出6种物质，其结果见表1，它们分别是脯氨酸甜菜碱（pro⁃line betaine）、尿酸（uric acid）、二甲基鸟苷（1，7-dimethylguanosine）、甘氨酸（glycine）、牛磺酸（taurine）和柠檬酸（citric acid）。

如表2所示，AESC 5和15 g·kg-1组脯氨酸甜菜碱和尿酸的相对含量明显低于正常对照组（P＜0.01）；AESC 1.5，5和15 g·kg-1组甘氨酸和牛磺酸的相对含量明显低于正常对照组（P＜0.05，P＜0.01）；AESC 1.5和15 g·kg-1组二甲基鸟苷和AESC 15 g·kg-1组柠檬酸的相对含量明显低于正常对照组（P＜0.05，P＜0.01）；AESC 1.5 g·kg-1组柠檬酸的相对含量明显高于正常对照组（P＜0.01）；另外，随AESC给药剂量的增加，大鼠尿液中脯氨酸甜菜碱、尿酸、甘氨酸和牛磺酸含量呈减少趋势（P＜0.01），而AESC 1.5 g·kg-1组柠檬酸的相对含量显著升高（P＜0.01）。结果表明，相应内源性代谢成分相对含量呈规律性改变，且具有一定的剂量相关性，提示这些内源性化合物的改变与决明子药理作用机制有关。

Fig.5 S-plots（A，B）and VIP values（C，D）associated with the OPLS-DA obtained for data derived from normal control group（A，C）and AESC-treated group（15 g·kg-1）after rats were ig given AESC for 14 d in ES＋（A，C）and ES－（B，D）.

Tab.1 Potential biomarkers in urine endogenous metabolites and their metabolic pathways affected by AESC

Tab.2 Effect of AESC on relative contents of proline betaine，uric acid，1，7-dimethylguanosine，glycine，taurine and citric acid in urine of rats

3 讨论

研究显示，牛磺酸能有效降低血清总胆固醇与动脉粥样指数，降低心脑血管疾病的风险［10-11］，决明子可能降低牛磺酸的排泄，而起到降血脂的作用，牛磺酸水平增加是急性肝损伤的标志［12-13］。通过对比AESC给药组，牛磺酸水平在给药14 d后显著下降，提示肝可能是决明子的药性靶器官，也可能是决明子保肝作用的主要机制之一。

尿酸是嘌呤的代谢最终产物，而嘌呤是核酸的氧化分解的代谢产物。有研究显示，当心肌缺血和（或）心肌能量供应不足时，ATP降解产物次黄嘌呤、黄嘌呤增多，在代谢为最终产物尿酸的过程中，产生大量的ROS，因此尿酸水平的下降，预示着决明子对心血管疾病有很好的预防作用［14］。研究表明，尿酸是DN的一种介质，可通过增强肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性和炎症级联反应等途径介导DN的发生，加重糖尿病患者的肾损伤程度，AESC给药后尿酸水平下调，可减少高尿酸水平对肾的损伤，从而发挥治疗DN的作用［15］。

甘氨酸能明显降低体内脂肪含量，对高脂血症肝脂肪变性有抑制作用，AESC给药组大鼠尿液中甘氨酸下降，推测其可能主要影响肾小管排泄功能，达到降血脂、肝保护作用［16］。

二甲基鸟苷是RNA的降解产物，其浓度增加是tRNA甲基转移酶活性与能力高度表达的结果，安卓玲等［17］研究发现，二甲基鸟苷在药物性肝损伤患者血清中的浓度异常增高，提示其可能为药物性肝损伤相关的可能生物标志物。本实验AESC给药组大鼠尿液中二甲基鸟苷水平显著下降，提示可能是肝保护作用的生物标志物。

有研究表明，三羧酸循环产生的ATP是组织细胞能利用的主要能源来源，三羧酸循环中柠檬酸含量的下降对线粒体中的能量代谢有很大影响［18］。本研究发现，AESC 1.5 g·kg-1组柠檬酸水平与未给药组相比含量显著上升，AESC 15 g·kg-1组显著下降，提示AESC 5和15 g·kg-1组可能通过影响能量代谢紊乱导致线粒体功能受损，可能是其蒽醌类物质潜在的肝毒性机制之一，但需进一步的深入研究。脯氨酸甜菜碱可作为决明子摄入的一个生物标志物，但其生物学意义尚不清楚，今后的研究将继续对可能的生物标志物结构进行鉴定，并深入阐述其生物学意义，为药物作用机制提供依据。

综上所述，本研究采用UPLC-Q-TOF/MS，进行了决明子对大鼠尿液内源性代谢产物的影响研究。共鉴定出6种内源性代谢产物，说明决明子通过影响牛磺酸代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢、能量代谢等通路发挥药理作用，从整体角度初步阐明了决明子药效作用机制，为传统中药的药效评价和临床应用提供一定的参考。

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Effect of aqueous extract of Semen Cassiae on endogenous metabolomics in urine of rats

XU Long-long1，2，TANG Xiang-lin2，LIANG Qian-de2，LI Jie2，WANG Yu-guang2，MA Zeng-chun2，XIAO Cheng-rong2，TAN Hong-ling2，GAO Yue1，2
（1.Graduate School of Anhui Medical University，Hefei 230032，China；2.Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of aqueous extract of Semen Cassiae（AESC）on endogenous metabolites in urine of rats by metabolomics based on ultra-performance liquid chroma⁃tography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry（UPLC-QTOF-MS）to reveal the possible ways of metabolism and mechanism of action in rats caused by AESC.METHODS Twsenty-eight male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly equally divided into 4 groups：such normal control group，AESC 1.5，5 and 15 g·kg-1groups.After intragastric administration for 14 d，the urine was collected with metabolic cages.The urine metabolic profiling was analyzed using UPLC-QTOF-MS，based on which the principal component analysis（PCA）and orthogonal partial least-squares discriminant analysis（OPLS-DA）models were established for metabolomic analysis.Potential biomarkers were screened using variable importance in the projection（VIP）andttest.RESULTS The results of PCA showed that samples of each group were clustered，all the groups were separated，and that the distance between AESC groups and normal control group was increased in a dose-dependent manner.The relative content of proline betaine and uric acid were 18.4±2.3 and 15.7±2.0，16.3±4.5 and 14.7±3.0 in the AESC 5 and15 g·kg-1groups，significantly lower than that of the normal control group，which was 25.0±3.4 and 29.0±4.8（P＜0.01），but that of AESC 1.5 g·kg-1group did not statistically differ from that of normal control group.In AESC 1.5，5 and 15 g·kg-1groups，the relative content of glycine and taurine was 10.0±1.4 and 8.0±1.4，3.6±0.7 and 66.5±7.3，45.8±23.6 and 23.0±9.8，which was significantly lower than that of the normal control group，which was 14.6±1.9 and 102.5±25.8（P＜0.01）.The relative content of 1，7-dimethylguanosine was 4.5±1.2 and 4.6±0.1 in AESC 1.5 and 15 g·kg-1groups，significantly lower than that of the normal control group，which was 6.5±0.8（P＜0.05），but AESC 5 g·kg-1group did not statistically differ from normal control group.The relative content of citric acid was 26.6±6.3 in the AESC 15 g·kg-1group，significantly lower than that of the normal control group，which was 67±14（P＜0.01）.The relative content of citric acid was 104±20 in the AESC 1.5 g·kg-1group，significantly higher than that of the normal control group（P＜0.01），but AESC 5g·kg-1group did not statistically differ from normal control group.CONCLUSION AESC can remarkably change endogenous metabolites and mainly affect the pathways of taurine，purine，amino acid and energy metabolism.

Semen Cassiae；metabolomics；biomarkers；urine

s：GAO Yue,E-mail:gaoyue@nic.bmi.ac.cn，Tel：（010）66931312；TANG Xiang-lin，E-mail：tangxianglin@139.com，Tel：（010）66931225

R285

A

1000-3002-（2016）11-1164-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.11.006

Foundation item：The project supported by National Science and Technology Major Project（2014ZX09304307-001-003）；National Science and Technology Major Project（2015ZX09501004-003-003）；Administration of Traditional Chinese Medicine of China（201507004）；and Beijing Municipal Natural Science Foundation（7164291）

2016-04-20接受日期：2016-09-01）

（本文编辑：沈海南）

国家科技重大专项（2014ZX09304307-001-003）；国家科技重大专项（2015ZX09501004-003-003）；中医药行业专项（201507004）；北京市自然科学基金资助项目（7164291）

许龙龙，男，硕士，主要从事中药药理学研究，Tel：（010）66930267，E-mail：xulonglong1020@163.com

高 月，E-mail：gaoyue@nic.bmi.ac.cn，Tel：（010）66931312；汤响林，E-mail：tangxianglin@139.com，Tel：（010）66931225