白酒大曲酵母菌的筛选

孙晓璐,　张新红,　王明跃

(阜阳职业技术学院 生化工程学院， 安徽 阜阳　236031)



白酒大曲酵母菌的筛选

孙晓璐,张新红,王明跃

(阜阳职业技术学院 生化工程学院， 安徽 阜阳236031)

摘要：对某酿酒企业提供的春季大曲进行了分离、纯化。通过对具有明显酵母菌特征的微生物进行生理、生化实验，得到6株性能优良、形态特征明显的酵母菌。通过实验比较得到具有一定优势的Q2菌株。

关键词：白酒; 酵母菌; 分离

0引言

大曲是酿造传统大曲酒的糖化剂、发酵剂和增香剂，也是传统白酒酿造的中间原料和生产动力，含有多种微生物及产生的多种酶类，在酿造过程中起着重要的糖化、发酵和生香的作用，直接间接地影响着白酒的质量和风格。

浓香型白酒大曲的制作工艺为自然发酵，富集了原材料和环境中的微生物，微生物区系十分复杂，酵母菌是大曲主要功能微生物菌群之一，主要有产酒的酒精酵母类群和产香的产酯酵母类群，不同类群酵母菌的数量及构成对大曲酒产率及风格特征具有极大影响[1]。因此，研究大曲中酵母菌的组成对提高大曲质量有重要意义，文中对皖北地区某酿酒企业提供的春季大曲进行了分离、纯化，通过对具有明显酵母菌特征的微生物进行生理、生化实验，通过实验比较得出在发酵过程中性能优良具有工业利用价值的优势菌株，为酿酒企业提供了数据支撑，在实际生产中具有一定的指导意义[2]。

1材料与方法

1.1　样品

大曲：皖北某酿酒企业，春季大曲。

1.2　试剂和设备

孟加拉红、青霉素钠、TTC、95%乙醇、苯酚红、美蓝、氯化钠、葡萄糖、酵母膏和牛肉膏等。

仪器：超净工作台、低温离心机、压力灭菌锅、冰箱、数显恒温振荡器、恒温水浴锅、无菌滤膜、分析用天平、微波炉、精密pH计、鼓风干燥箱、普通光学显微镜、荧光倒置显微镜、安捷伦高效气相色谱仪。

培养基：YEPD培养基、豆芽汁培养基、TTC培养基、保藏用斜面培养基。

2实验方法

2.1　酵母菌的分离

取大曲10 g，以无菌操作加入到无菌水500 mL中，取菌液涂布于YEPD固体平皿，27 ℃培养72 h，长出乳白色菌落，选择具有典型酵母菌落特征的单菌落，划线分离3次，经镜检为纯种后用接种针接入斜面培养基，长出后菌落于低温保存。

2.2　酵母菌的筛选

TTC染色：选择菌落数合适的YEPD平板，侵入48 ℃左右的TTC培养基覆盖菌落，凝固后避光在27 ℃保存3 h，观察菌落颜色变化。通过观察酵母菌菌落被TTC染成橙色的深浅，来判定该菌株发酵产酒精能力的强弱，从中挑选出染色较深、形态特征明显的单菌落，用接种针划开TTC培养基层，挑出优势菌株，接入固体斜面培养基进行低温保存[3-4]。

2.3　大曲中酵母菌的形态观察

2.3.1大曲酵母菌的个体镜检

取美蓝染色液，制作临时装片，于100×油镜下观察细胞形态，记录菌体形态、大小、出芽情况。

2.3.2大曲酵母细胞的倒置显微镜观察

取菌体形态明显的酵母菌，置于荧光倒置显微镜下进行测定，得到相关酵母菌形态图像进行比较。

2.4　酵母菌菌落观察

将保藏的优势菌株分别进行YEPD固体培养基和液体培养基生长，观察菌落的大小、形状、颜色、透明度、边缘、质地，以及在液体培养基中菌落的浑浊度、有无气泡等生理特征进行观察，记录。

2.4.1菌悬液的制备

取10 mL发酵液进行低速离心分离，洗涤菌体3次后，将所得菌体于10 mL 0.9%的生理盐水中，制得菌体悬浊液，依次稀释到10-3倍、10-2倍、10-1倍，通过紫外分光光度计测定菌体密度。

2.4.2标准曲线的绘制

用紫外分光光度计调制在波长560 nm处测空白的YEPD液体培养基，绘制标准曲线。

3实验结果与讨论

3.1　复筛后几株酵母菌的特性观察

在传统大曲酒发酵过程中，酵母发酵产酒精过程需要大量的五谷为原料，近几年来，由于原料价格不断提高，在一定程度上促使人们往价格低廉的麸糠等原料转移。优势酵母不单能够利用淀粉水解产生的大部分寡糖，包括比麦芽三糖链更长的糊精和异麦芽糖，还能够分解一定的纤维素糖，因此，在对酿酒酵母的发酵性能上必定具有一定要求，该菌株应该具有生产迅速，并能够对低糖含量的原料进行充分利用、不易染菌等优势[5-6]。

通过初筛得到若干菌株，对长势优良、具有明显酵母菌特征的菌株进行挑选，得6株优势菌株进行复筛实验，通过观察几株酵母菌的形态、菌落特征得到相关数据,并对其进行分析。

酵母菌的菌落特征及呼吸强度观察见表1。

由表1可以看出，初筛、复筛得到的6株酵母菌在菌落特征、呼吸强度上均体现出了不同的情况，分析具体情况得到以下结论，在初期生长的12 h时，酵母菌均无明显变化，在生长24 h后，有部分菌株进入了成长阶段，其中Q1，Q2，Q4为最先成长菌株。

在进入36 h时，Q6菌株出现了与其它不同的微黄色,但生长缓慢，菌株生殖方式为多边芽殖，孢子呈椭圆形向外围散开，在成长较快的菌株Q1，Q2，Q4的平皿上出现了表面圆滑乳白色的菌落，进入到快速生长阶段；通过第72 h后的观察，可以看到先生长的Q1，Q2，Q4的平皿上出现了表面干燥有褶皱现象，边缘不整齐，开始进入菌体老化阶段，Q6菌株出现了黄色凸起菌落。

表1　酵母菌的菌落特征及呼吸强度观察

注：-为无明显变化；+为酵母生长较慢；++为酵母生长平稳；+++为酵母生长较快。

3.2　优势酵母菌的细胞特征观察

采用荧光倒置显微镜对优势酵母菌Q1，Q2，Q4，Q6进行观察，各菌株细胞分别呈现为卵圆形和椭圆形，芽殖大小为3~7 μm，分别为Q1，Q2，Q4，Q6，其中Q6可以观察到较明显的裂殖现象，如图1所示。

图1　酵母菌Q1，Q2，Q4，Q6美蓝染色结果

3.3　优势酵母菌的发酵性能分析

将优势菌株Q1，Q2，Q4，Q6通过YEPD的发酵液培养72 h，在发酵过程中对各菌株的发酵液进行定时采样，分析其在发酵过程中酸碱度及酒精度，见表2。

表2　优势酵母菌的发酵性能分析

由表2可以看出，在发酵过程中各菌株的酸碱度变化不大，酒精含量在发酵72 h后都可以达到最大值，其中Q2酵母菌在发酵72 h后酒精产量为最高，说明该菌株在大曲酵母中占有明显优势，可以作为发酵过程中的主要生产菌株[7-8]。

发酵时间短，产生酒精能力强,这和酵母菌在酒精生产中有一定的要求是一致的，酵母菌在酒精生产中要发酵能力强并且迅速，有较强的增殖能力，对乙醇具有一定的耐受力，能在较高浓度的酒精发酵醪液中发酵，生产性能稳定，变异性小，发酵过程中产生较少量泡沫，可以抵抗杂菌，可视为生产优势菌株[9-10]。

4结语

本研究以白酒酿造中春季大曲为主要研究对象，分离、筛选并纯化出具有一定特性的优势酵母菌菌株，通过不同酵母菌种的菌株的特性分析，初步研究了大曲中酵母菌群系的特性[11-12]。菌种的分离纯化在方案设计上做到了全面、细致、不丢。因此，保证菌种样品都进行了3~4次的分离，分离培养的温度应适合大多数的酵母菌的生长温度27 ℃。

酵母菌的鉴定主要以形态特征为主,并结合生理学特性，在形态特征的鉴定上包括菌株形态、细胞形态、芽孢特征，在生理鉴定上可以通过酸度发酵和产酒精量确定菌株的发酵性能。以其中6种菌株为出发菌株，进行生理生化实验，筛选出具有明显发酵优势的Q2菌株。

参考文献：

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[5]李建武,余端元,袁明秀.生物化学实验原理和方法[M].北京:北京大学出版社,1994：311-315.

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[11]张志，杨玉民，刑龙飞.安琪耐高温酒精活性干酵母在酒精生产中的应用[J].酿酒，1997(2):61-63.

[12]Gray W D. The physiological basis of ethanol tolerance in yeasts[J]. Bacteriol,1991,42:561-574.

Screening of wine yeast in liquor

SUN Xiao-lu,ZHANG Xin-hong,WANG Ming-yue

(Vocational Technical Institute, Fuyang Vocational Technical College, Fuyang 236031, China)

Abstract：The alcohol from northern Anhui area is separated and purified. The obtained microorganism with saccharomycetes(wine yeast) characteristics are tested in physiological and biochemistry lab to get 6 kinds of fine and obvious saccharomycetes. Experimental results show that Q2 is superior to the others.

Key words：liquor; saccharomycetes; separation.

作者简介：孙晓璐(1981-)，女，汉族，安徽太和人，阜阳职业技术学院讲师，硕士，主要从事微生物技术方向研究,E-mail:303028607@qq.com.

基金项目：安徽省高等学校优秀青年人才基金重点项目(2013SQRL137ZD); 安徽省高等学校自然科学研究项目(KJ2012B140); 安徽省教育厅质量工程项目(20101336)； 阜阳职业技术学院精品课程(2013zycxkc02)

收稿日期：2014-09-11

中图分类号：TQ 925

文献标志码：A

文章编号：1674-1374(2015)01-0081-04

DOI:10.15923/j.cnki.cn22-1382/t.2015.1.17