细胞免疫检测试验在结核病中的诊断价值

辛宝林 于秀坤

(大庆市疾病预防控制中心，黑龙江 大庆 163311)

细胞免疫检测试验在结核病中的诊断价值

辛宝林 于秀坤

(大庆市疾病预防控制中心，黑龙江 大庆 163311)

目的评估细胞免疫检测试验在结核病中的诊断价值。方法 研究对象来自于2013年2月至2015年5月于我中心就诊的疑似结核病患者66例。取患者晨起喉深部痰液用于涂片法和罗氏固体培养法，取患者晨起肘静脉血5 mL用于细胞免疫检测试验。以罗氏固体培养法结果为参照。分析3种检查结果的一致性。结果 细胞免疫检测试验的灵敏度为94.59%、特异度为100%、准确度为96.97%。涂片法免疫检测试验的灵敏度为64.86%、特异度为86.21%、准确度为74.24%。细胞免疫检测试验准确度高于涂片法，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 细胞免疫检测试验的准确性高，优于涂片法，可作为结核病早期诊断可靠的检测手段。

细胞免疫检测试验；结核病；结核分枝杆菌；涂片法；罗氏固体培养法

结核病是结核分枝杆菌感染导致局部组织变性坏死并引发一系列的免疫反应的疾病，该病传染性高，单因素致死率高，严重威胁着人类健康。我国是结核病高负荷国家，2010年调查数据显示，我国活动性肺结核患者523万，年发病人数130万，居世界第二位，仅次于印度[1]。近年来，结核病的早期确诊成为研究热点，实验室检测方法分为细菌学、血清学、分子生物学和细胞免疫学等[2]。细菌学和血清学手段准确性差，而分子生物学技术费用昂贵，细胞免疫学方法则成为结核病诊断新的选择。本研究观察了细胞免疫检测试验诊断结核病的准确性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 样本来源：研究对象来自于2013年2月至2015年5月于我中心就诊的疑似结核病患者66例，其中男38例、女28例，年龄19～55岁，平均年龄（33.7±7.4）岁，病程1个月～2年。血样本用肝素锂抗凝的真空采血管取患者晨起肘静脉血5 mL应用于细胞免疫检测试验。痰样本取患者晨起喉深部痰分为2份用于罗氏固体培养法和涂片法。

1.2 细胞免疫检测试验：血样本需在4 h内送检。将等体积的RPMI1640培养液和等体积的Ficoll淋巴细胞分离液上层与血样本混匀，温度设置为18 ℃，以1000 r/min的速度离心20 min。分离中层单个核细胞，放入新的15 mL无菌离心管中，加RPMI1640培养液使液体总体积至10 mL，再将单个核细胞洗掉，温度设置为18 ℃，以600 r/min的速度离心7 min，将上清液弃掉。取AIM-V培养液1 mL重悬细胞，等细胞沉淀后继续AIM-V培养液使液体总体积至10 mL，温度设置为18 ℃，以350 r/min的速度离心7 min，将上清液弃掉。获得的稀释细胞工作液浓度为2.5×102个/μL。在抗原A孔中加入ESAT-6抗原50 μL，抗原B孔中加入CFP-10抗原50 μL，阴性对照孔中加入AIM-V细胞培养液50 μL阳性对照孔中植物血凝素50 μL。在上述4孔中各加入制备好的稀释细胞工作液100 μL。培养箱温度设置为37 ℃，二氧化碳浓度为5%，孵育20 h。将抗原致敏效应T淋巴细胞洗涤去，加入生物素标记的二抗后酶联显色。结果为阳性判读应符合下列情况之一：空白对照孔内斑点数＜6时，而其他3孔中任意一孔斑点数－空白对照孔内斑点数≥6；空白对照孔内斑点数≥6时，而其他3孔中任意一孔斑点数2倍于空白对照孔内斑点数。

1.3 罗氏固体培养法：将等体积的4%氢氧化钠溶液加入到痰样本中，涡旋振荡器震荡20 s，室温下静置15 min后，接种0.1 mL样本于培养基斜面上，放置于培养箱中37 ℃下孵育。接种3周后开始观察，每周一次，8周内发现菌落生长则为阳性。

1.4 涂片法：将等体积的4%氢氧化钠溶液加入到痰样本中，采用涡旋振荡器震荡20 s使其均匀化，室温下静置15 min。取痰样本于玻片正面的靠右端2/3处中央涂抹卵圆形痰膜，自然干燥，紫外线灯下照射持续30 min～1 h，微火固定，滴加0.8%石碳酸复红溶液，微火加热5 min，细流水洗去染色剂，沥干水分。于痰膜上端外缘滴3%盐酸乙醇溶液脱色沥干水分，再次用细流水洗去脱色剂，沥干水分。然后用0.1%亚甲蓝溶液复染，30 s后用细流水洗去复染剂，沥干水分，涂片自然干燥后镜检。红色为阳性。

1.5 统计学分析：所有数据均采用SPSS21.0统计学软件整理统计。以罗氏固体培养法结果为参照，计算细胞免疫检测试验和涂片法的灵敏度、特异度和准确度。准确度比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

罗氏固体培养法结果为阳性56.06%（37/66），阴性44.94%（29/66）。细胞免疫检测试验结果为阳性53.03%（35/66），阴性46.97%（31/66）。涂片法结果为阳性42.42%（28/66），阴性57.58%（38/66）。细胞免疫检测试验的灵敏度为94.59%（35/37）、特异度为100%（29/29）、准确度为96.97%（64/66）。涂片法免疫检测试验的灵敏度为64.86%（24/37）、特异度为86.21%（25/29）、准确度为74.24%（49/66）。细胞免疫检测试验准确度高于涂片法，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

ESAT-6为结核分枝杆菌分泌的6-kDa早期分泌靶蛋白，由RD-1区RV3875基因编码，抗原性和免疫原性强[3]，可调节固有免疫反应的细胞功能，并为结核分枝杆菌特异性抗原。CFP-10为结核分枝杆菌R3874基因编码，也属于为结核分枝杆菌特异性抗原。ESAT-6和CFP-10与大多数非结核分枝杆菌不存在抗原交叉。细胞免疫检测试验是采用ESAT-6和CFP-10作为刺激原，刺激与结核分枝杆菌相关的效应T淋巴细胞分泌细胞因子，然后再与相应酶标记抗体结合联动显色底物发生反应，显色底物在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点[4]。试验结果为阳性时所显示的斑点则为与结核分枝杆菌相关的效应T淋巴细胞。同时采用两种抗原可改善单一抗原不能包含所有表位的局限性，提高结核病诊断敏感性[5]。细胞免疫检测试验具有操作简单、周期短、敏感度和特异度高等优点[6]。

本研究结果显示细胞免疫检测试验的灵敏度为94.59%、特异度为100%、准确度为96.97%。细胞免疫检测试验准确度高于涂片法，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示细胞免疫检测试验的准确性高，优于涂片法，可作为结核病早期诊断可靠的检测手段。

参考文献

[1] 王玲玲,李辉,谢风.结核分枝杆菌几种临床检测方法的比较[J].中国实验诊断学,2013,17(11):1992-1995.

[2] 藏旭斌,张萌,宁永忠.诊断结核病的实验室技术现状[J].中国现代医药杂志,2014,16(8):102-104.

[3] 赵青,冯国栋,王雯菁,等.结核分枝杆菌及抗原ESAT-6、Ag85B对中性粒细胞白三烯B4表达的影响[J].医学研究杂志,2015,44(5):20-24.

[4] 刘幸福,苏惠青,罗宏.结核感染T细胞斑点检测在综合医院应用评价[J].实用医技杂志,2015,22(5):522-523.

[5] 陈翠翠,叶娟,赵俊伟,等.复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核辅助诊断中的价值[J].郑州医科大学(医学版),2014,49 (2):211-214.

[6] 刘红,黄永杰,王静,等.结核感染T细胞斑点试验在疑似结核病患者诊断中的价值研究[J].中华结核和呼吸杂志,2014,37(3):192-196.

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1671-8194（2016）36-0129-02