脑缺血动物模型构建的研究现状与展望

朱穆楠　尚　坤

1.长春中医药大学,吉林　长春　130117;2. 吉林省儿童医疗中心长春市儿童医院,吉林　长春　130021



脑缺血动物模型构建的研究现状与展望

朱穆楠1，2尚坤1*

1.长春中医药大学,吉林长春130117;2. 吉林省儿童医疗中心长春市儿童医院,吉林长春130021

缺血性脑血管病(ICVD)是指局部脑组织包括神经细胞、胶质细胞及联系纤维由于供血障碍发生的病变、坏死或一过性的功能丧失。为了系统地研究缺血性脑血管病，建立一个接近临床的，重现性好，可控的脑缺血模型是有必要的。笔者对大鼠脑缺血模型及体外模型的复制方法、模型特点及影响关系等方面进行概述，发现存在两大问题：一是目前大多数模型构造以青年大鼠为研究对象，但缺血性脑血管病多发于老年人，青年大鼠的生理学和病理学与临床脑血管病存在差异，存在青年大鼠模型的假阳性结果；二是临床上缺血性脑血管病的发病机制复杂，常伴有动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等疾病，但目前模型的复制往往采用单一因素导致脑缺血，与临床实际存在差距。因此，现阶段对于老年脑缺血模型的制备方法还很缺乏，建立一个符合临床发病特点，操作简便稳定、重复性好的脑缺血动物模型刻不容缓。

缺血性脑血管病；老年大鼠；动物模型；体外模型

缺血性脑血管病(Ischemic Cerebrovascular Disease,ICVD)是指局部脑组织包括神经细胞和胶质细胞及联系纤维由于供血障碍发生的病变、坏死或功能瞬态损耗[1]。目前，缺血性脑血管疾病在全部脑血管病中约占80%，并且脑缺血疾病有着发病率高，死亡率高，复发率高，致残率高等特点。调查发现，许多因素与此疾病的发生有着密切的关系。其中，可干预性因素有高血压、心血管疾病、糖尿病、高血脂症等；不可干预性因素有年龄、性别、种族和卒中家族史等。为了更加系统地研究缺血性脑血管病的发病机制、病理过程、诊断及观察药物的治疗作用，建立一个接近临床、重现性好且可控的脑缺血模型是很有必要的。

近5年的文献研究表明，脑缺血模型的制备主要包括脑缺血动物模型和体外模型两种类型[2-4]，均以大鼠作为实验动物。本文将近5年的文献进行整理，对老年大鼠脑缺血模型及体外模型的复制方法、模型特点以及影响关系等进行综述。

1　老年大鼠脑缺血动物模型的制备

由于在临床上，脑血管意外多发于老年人，因此本文重点关注老年大鼠脑缺血动物模型的制备。由于老年鼠的耐受性差，脑血管狭窄曲折和扩张，导致动物死亡率高，模型重复性差[5-6]，因此文献中缺血性脑血管病的动物模型多以青年大鼠为主，这与临床脑血管病多为老年人发病的实际不符，应该引起相关研究人员的注意。

1.1老年大鼠局灶性脑缺血模型局灶性脑缺血是指在某个特定脑区的脑血流量降低。文献中采用的局灶性脑缺血模型的复制方法有开颅机械闭塞大脑中动脉法、微栓子栓塞法、线栓法、光化学法及化学物质直接损伤法等。这些模型制备方法特点不尽相同，各有利弊。目前实验中常用的模型复制方法是光化学法和线栓法。1.1.1光化学法杨渊等[7]建立了光化学诱导老年大鼠局灶脑缺血模型，该模型主要利用化学物质刺激血管引起收缩，或通过直接引起血栓来复制脑缺血模型。选取雄性Wistar大鼠，26月龄(相当于人类70岁)，体重380～560g。用0.4%戊巴比妥钠腹腔内麻醉后，纵向切开头皮，暴露右侧颅骨后分离骨膜，在颅骨表面覆以中间带有圆孔的避光纸，孔径为0.4cm，圆心位于前囱后约1.8cm，中线旁右侧2.5cm，下为感觉运动皮质中枢。从股静脉缓慢注入光敏染料Rose Bengal，之后将大鼠固定在立体定位仪上，用冷光源探头接近暴露的颅骨，照射强度为300～320klx，照射时间为30min[8]。

在复制此模型时应注意：①戊巴比妥钠的用量应调整为青年大鼠的80%;②在注射Rose Bengal时，速度应慢，约为3～5min匀速注入，否则易引起呼吸困难甚至死亡;③当金属卤钨灯使用一段时间后，照射强度会衰减，当低于250klx时，很难形成病灶，为使病灶稳定性好，应提前测量照射强度，并勤换灯泡，维持病灶恒定出现。

光化学法复制模型的特点是可任意选定栓塞部位，且部位恒定、栓塞大小及部位重复性好，大鼠存活率高，可有效避免年龄错配，与临床发病生理学和病理学不符等缺点，更适合于验证老年人缺血性脑血管病干预治疗的研究[9-10]。

1.1.2线栓法1985年，Koizumi等[11]在日本卒中会议上首次提出利线栓法恢复脑血流的大鼠局灶性造血模型。刘宗涛等[12]用同侧颈总动脉永久结扎大脑中动脉线栓法制备出老年大鼠脑中动脉梗死模型。具体方法是选取28月龄健康雄性SD大鼠，仰卧固定，做颈部正中切口并分离颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)， 结扎颈外动脉分支，用0.28mm的尼龙线由ECA插入ICA，当到达大脑中动脉起始处时，停止插入，向外稍稍拉出一点，即可实现从大脑中动脉起始端堵塞大脑中动脉所有的血液来源，随后将颈总动脉与尼龙线一起结扎，扎紧备线，关闭并缝合颈部的手术切口。即复制局灶性脑缺血预处理模型或脑卒中模型。

线栓法复制模型的特点是不需要开颅手术，避免手术对老年大鼠脑组织的创伤和刺激作用，方法简便，重现性好，易于掌握，与临床指标的吻合度高，是目前应用广泛的脑血管疾病模型的复制方法。1.2老年大鼠全脑缺血模型全脑缺血是指全部或大部分脑区的血流量降低。全脑缺血模型大致可分为蒙古沙鼠两血管阻断模型、大鼠两血管阻断模型、大鼠三动脉阻断(3-VO)前脑缺血模型、大鼠四血管阻断(4-VO)前脑缺血模型以及断头缺血模型等。这些模型都是通过闭塞相应血管造成永久性全脑缺血，或通过反复闭塞造成短暂性全脑缺血反复发作来模拟人类全脑缺血的过程[13-15]。这些方法对于慢性脑缺血、脑缺血的药物以及某些特殊领域研究具有较高的价值。但因其对全身影响大，仅有四血管阻断(4-VO)前脑缺血模型可用于老年大鼠的全脑缺血模型复制。

贾彦芳等[16]参考Pulsineli法复制了老年大鼠的全脑缺血模型。选用19～21个月(相当于人类60岁[17])、体重为520～750g的雄性Wistar大鼠使用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，俯卧固定于实验台上，逐层暴露直至第一颈椎双侧翼孔，用电凝针尖端探入翼孔烧灼经翼孔走行的椎动脉[18]，缝合切口。后将大鼠仰卧固定，分离双侧颈动脉并置线结成线环，缝合切口。24h后，重新解开切口，提起线环并暴露双侧颈总动脉，用血管夹同时夹闭双侧颈总动脉，达到预定缺血时间后撤去血管夹，造成老年大鼠的全脑缺血模型[19-20]。

四血管阻断(4-VO)复制模型的特点是操作简便易掌握，大鼠可在清醒状态下操作，避免麻醉对老年大鼠带来的影响及损伤，同时也与临床上因低血压休克或心肺脑复苏而造成的全脑缺血性损伤过程相似。本法更方便运用于大型实验当中，并可对严重的前脑缺血进行再灌注实验。

2　体外模型的制备

动物模型虽然更接近疾病的实际情况，但操作复杂，容易受到其他因素干扰。建立一种方便有效的体外模型是研究脑缺血损伤的一种行之有效的方法。体外模型主要是通过细胞培养获得单一的细胞群体，根据实验的需求控制神经细胞的生长，排除不利的干扰因素，从而获得优质的脑缺血模型[21]。体外模型的制备主要采用的是体外细胞培养技术，是指将有机体的活细胞放于模拟体内环境的体外环境中生长和发育。由于此法的细胞成分单一，具有易于控制环境因素、重复性好等特点，故而近年来成为疾病研究的重要手段[22]。

研究表明，在啮齿类动物的脑缺血模型中，海马是最易损伤的脑区之一。海马神经元通过体外培养能够发育成熟，表达神经元的抗体，并具有成熟的神经元形态。因此，离体培养海马脑片广泛用于脑损伤的研究中，是模拟脑缺血常用的一种体外模型制备方法，已经开始应用于病理、电生理和药理学的研究中。

2.1海马神经细胞的原代培养法选取孕期为17～20d的Wistar孕鼠，用CO2麻醉孕鼠，颈椎脱臼处死，切开腹部皮肤，暴露子宫，取胎鼠于解剖液中，剪开颅骨去除全脑放于解剖液培养皿中，分离海马组织除去血管后剪碎组织置于15mL的离心管中，离心后去上清液加25%tryp-sin 3mL，在37℃温育15min，吸出胰蛋白酶消化液，加入3mL种植液，摇匀后静置，吸除上清液，重复操作一次，彻底去除胰蛋白酶，最后加入3mL种植液，吹打分散组织制成细胞悬液，过200目筛。计数细胞后，按1×105接种在多聚赖氨酸培养板中置于CO2培养箱中，第二天换用Neurobasal TM Media培养基，每3d换半两培养基，2周后即可。

原代培养法为缺氧袋结合血糖剥夺法，是通过延长缺血缺氧的时间，从而建立不同程度的脑缺血损伤模型，可用于研究脑缺血损伤的发生及发展机制。此模型的特点是可直接在正常空气环境下培养，不需要特殊的装置且不需要加入呼吸链来阻断药物。2.2海马组织切片培养法切片培养法可用于研究神经元死亡的细胞和分子机制，也是研究神经损伤、神经保护、神经修复及突触可塑性的良好模型。近年来，海马组织切片培养也用于神经系统疾病的研究。

选取出生6～7d的Wistar大鼠，断头快速取出脑组织并置于冰冷解剖液中，快速分离海马，用McIllwain切片组织刀将海马切片，将海马切片置于Millicell多空插入式细胞培养皿中，并放入含1mL培养液的6孔细胞培养板。置于35℃的5%CO2培养箱中培养12～14d。培养12～14d后，用脱氧的无糖无血清培养基冲洗培养的海马脑片或神经细胞，然后换培养基。将培养的组织移至恒温的小室，将空气换成95% N2/5%CO2，将海马切片暴露10min，随后用正常培养基冲洗组织，放回正常条件的培养箱培养。

切片培养法主要是模拟整体动物的缺氧缺血状态，是常用的脑缺血损伤的体外模型，可用于筛选神经保护剂，也可用于阐述药物的作用机制。

值得注意的是，体外培养技术虽然具有能够长时间直接观察活体细胞的形态结构和生命活动、易于施用物理化学或生物等实验条件、便于药物筛选、用药损耗少、出结果快等优点，但神经细胞离体后，独立存在的培养环境与真正的体内环境相比，仍有一定的差异，因此不能与体内细胞真正地等同起来，同时还要注意配合进行体内动物的研究。

3　展望

通过对脑缺血动物模型构建的相关文献的整理研究发现，当前此存在有两大问题：一是目前大多数模型复制以青年大鼠为主，青年大鼠的生理学、病理学特点与老年大鼠存在差异，而临床上缺血性脑血管病多发于老年人，因此以青年大鼠模型开展相关实验研究容易出现假阳性的结果；二是临床上缺血性脑血管病的发病机制复杂，常伴有动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等疾病，但目前模型的复制方法较为简单，往往采用单一因素导致脑缺血[23]，与临床实际存在着一定的差距。因此，虽然现阶段对于脑缺血动物模型构建的相关文献数量较多，但是大部分均脱离了临床实际，建立一套符合临床发病特点，操作简便稳定、重复性好的脑缺血动物模型刻不容缓。

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(编辑：梁志庆)

The Research Status and Prospect of Cerebral Ischemia Model

ZHU Munan1,2SHANG Kun2*

1.Changchun University of Tcm,Changchun 130117,China;2.JiLin Children’s Medical Center Children’s Hospital of Changchun， Changchun 130021,China

the Ischemic Cerebrovascular Disease (ICVD) refers to the local brain tissue including neural cells, glial cells level of fiber due to the pathological changes of blood disorders, necrosis or a loss of sexual function. The survey found that many factors and the occurrence of the disease have a close relationship, in order to systematically study to establish a close to clinical ischemic cerebrovascular disease, good reproducibility, controllable cerebral ischemia model is necessary. Due to the frequent ischemic cerebrovascular disease in the elderly, so in this paper, the elderly ischemic rats model and in vitro model replication methods, model features, summary of evaluation index and its effect on the relationship.

Cerebral Ischemia Model;Elderly Rats;Animal Models;In Vitro Model

2016-06-16

高等学校博士学科点专项科研基金项目，项目编号：20122227110003；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目，项目编号：吉教科合字[2014]第85号；吉林省卫生厅科研课题，课题编号：2012S007。

朱穆楠(1991-)，女，汉族，硕士，主要从事中药药理学研究。E-mail:2834934100@qq.com

尚坤(1978-)，女，博士，副教授，硕士研究生导师，研究方向为中医药治疗心脑血管疾病的临床与机理研究。E-mail：495218735@qq.com

R965.1

A

1007-8517(2016)17-0027-03