非典型牛海绵状脑病研究进展

李炎鑫，马贵平，刘全国，史喜菊，李冰玲，徐立伟

（北京出入境检验检疫局，北京　100026）

专论综述

非典型牛海绵状脑病研究进展

李炎鑫，马贵平，刘全国，史喜菊，李冰玲，徐立伟

（北京出入境检验检疫局，北京100026）

非典型牛海绵状脑病为新发现的一种朊病毒病，通常发生于老牛，与典型牛海绵状脑病在病理表型、分子表型和生物表型方面不同。本文结合已发表的文献，对非典型牛海绵状脑病的发现、病原特性、流行病学、检测、发病机理、动物模型研究和实验感染等方面的最新研究进展进行了概述，以期增强人们对该病的认识，并为我国防控该病提供借鉴。

非典型牛海绵状脑病；流行病学；检测；发病机理；传染性

牛海绵状脑病（BSE）又称“疯牛病”，是由朊病毒引起的牛的一种渐进性、致死性的中枢神经系统疾病，是人和动物的传染性海绵状脑病（TSE）中的一种。自从1986年在英国检测到第一例BSE以来，人们一直以为在牛中只有一种BSE病原株，然而2004年在法国和意大利发现了两种不同的BSE病原株，它们与典型BSE的致病性朊病毒蛋白（PrPsc）在蛋白酶抗性片段大小和糖基化模型方面的分子特征不同［1-3］。与典型BSE比较，这些非典型毒株在对不同品系的牛PrP转基因小鼠和牛进行动物感染实验中明确地表现出它们的感染性质和独特株表现型［2，4-5］。近年来多个国家先后报道了非典型BSE，瑞典、美国、巴西、挪威出现的本土病例均是非典型病例。最新研究暗示，典型BSE的起源可能是全球散发、流行率很低（流行率大约为每百万8岁以上牛中1～2例）的非典型BSE病例。

近年来，全球BSE病例呈逐年下降趋势，这充分验证了基于科学风险评估体系制定的BSE防控措施是有效的，特别是实施饲料禁令和加强主动监测。由于目前对非典型BSE的起因、致病机理和危害还不清楚，非典型BSE的出现又对BSE的监测和控制工作提出了新的挑战。

1　历史

2001年6月，欧盟宣布实施BSE全面监测计划，不但包括对疑似BSE症状的牛进行的被动监测，还包括对屠宰时24月龄以上的高风险牛群（死牛、伤残牛、倒地牛）和所有屠宰时30月龄以上的健康牛群都要进行的主动监测，以监控BSE的流行状况。随后其他国家也开始实施主动监测。蛋白免疫印迹试验（Western Blot）逐渐被应用于对疑似病例进一步确诊。法国、意大利和日本几乎同时在2003年发现了异常的抗蛋白酶K朊病毒（PrPres）电泳图。根据病原株经蛋白酶K消化和Western Blot显示的PrPsc分子量大小可分为H-BSE和L-BSE。H指分子量较大的PrPres［1］，L指分子量较小的PrPres，L-BSE也叫牛淀粉样变性海绵状脑病（BASE）。

H-BSE首先在法国发现。法国病例表明脑干延髓中无糖基化的PrPres分子量大于典型BSE分子量，此分离株命名为H-BSE。相反，意大利病例的PrPres分子量稍低于典型BSE，且单糖基化PrPres带的浓度达到了双糖基化PrPres的浓度。采集这些病例的脑组织进行免疫组织化学（IHC）分析发现，PrPsc的沉积分布与以往的BSE不同，在脑闩部位分布较少，更多的分布在脑腹侧部位的丘脑和嗅球，沉积主要以淀粉斑的形式。人类的TSE（如GSS、sCJD、库鲁和vCJD）也有类似报道。意大利研究人员将这种新确定的表型命名为牛淀粉样海绵状脑病（BASE）［3］。日本在2003年进行酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选BSE时发现一例23月龄可疑牛，用Western Blot试验检测同样是阳性，而且PrPSc的电泳条带糖基化模式与典型BSE对照样品不一样，PrPSc非糖基化带较粗，而组织病理学和免疫组织化学检查结果则均为阴性，但由于材料较少，没有进行进一步确认［6］。

非典型BSE病例大多出现在发生过典型BSE的国家，如法国、英国、德国、加拿大、美国等。但也有几例在没有发生过典型BSE的国家出现，如瑞典、巴西、挪威、罗马尼亚等，这是在全球BSE疫情显著减缓情况下新报道的发生BSE的国家。截至2015年底，全球共确诊了92例非典型性病例，其中报告了46例L-BSE、41例H-BSE。

2　流行病学

以前世界各国没有强制性要求对牛BSE病例进行分型，因此关于非典型BSE的流行病学信息是不完整的，这也给进一步的研究增加了困难。非典型性病例更容易在年龄较大的老牛中个别发生，年龄范围在8～20岁。对患牛出生时间的统计显示，非典型病例的出生时间大多在实施饲料禁令之前，零星分布且没有特定规律。

法国对所有在2001—2007年欧盟强制性监测中确定的TSE阳性牛进行了回顾性研究，结果显示，每百万头成年牛中，H-BSE和L-BSE的流行率分别为0.35%和0.41%，如果检测8岁以上牛，H-BSE和L-BSE的流行率分别提高到1.9%和1.7%［8］。

大多数BSE病例都出现在8岁以上成熟个体牛和老年个体牛，但有几例例外，是西班牙在2011—2012年间检测到的（其中一例为H-BSE，另一例为L-BSE）非典型病例以及瑞士在2012年检测到的一头2005年出生在德国的奶牛（H-BSE）［9］。检测到的H-BSE和L-BSE病例牛年龄普遍较高，且在牛群中的流行率明显较低，暗示这些非典型BSE病例可能是自发产生的。

除瑞士动物园发现的一头19岁的公牛有临床可疑症状外，欧盟BSE监测数据库中所有的非典型BSE都是通过主动监测发现的，其中58.75%来自死牛，37.5%来自健康屠宰牛，3.75%来自紧急屠宰牛。

非典型BSE能否垂直传播或者通过肉骨粉（MBM）饲喂传播仍需进一步调查。

3　非典型BSE的检测

由于非典型BSE的真实流行率还不确定，目前还没有充足的研究证明用于牛TSE快速检测的试验方法在检测非典型BSE时是否合理有效，无论是检测的灵敏度，还是其能否检测非临床感染的牛。Meloni比较了欧盟批准的商业化TSE快速检测试剂盒在检测典型BSE、L-BSE和H-BSE的灵敏度。虽然灵敏度有所不同，但根据生产商的说明书，所有的快速检测方法在1:16稀释后都能检测到三种不同的BSE型［10］。对C-BSE的病理学研究表明，异常的PrP在脑干沉积，最初在脑闩，尤其是潜伏期最后阶段有大量疫病特异的蛋白聚集［39］。因此在主动监测体系中，采集脑干的脑闩部位进行C-BSE快速检测是最灵敏的方法。目前检测到的非典型BSE都是通过主动监测发现的，脑闩部位能否适合早期、灵敏检测非典型BSE仍有争议，但目前检测脑闩的方法至少能够检测出一部分非典型BSE。有研究表明IHC能够鉴别区分C-BSE、H-BSE和L-BSE的免疫标记型，尤其是检测脑的腹侧部位和小脑［23］。Western Blot根据PrP无糖基化部分分子量和识别朊蛋白N端表位抗体检测能够快速确定H-BSE；根据PrP无糖基化部分的较低分子量和改变的糖基化模式（双糖基化和单糖基化量相同）来确定L-BSE。目前欧盟TSE法规规定用蛋白免疫印迹方法来分型。

4　发病机理

由于缺乏完整的资料，关于非典型病例的发病机理和病因，目前尚无确切结论。实验研究数据能多大程度代表真实自然感染牛的病原分布，受到假定的非典型BSE起源的影响。如果非典型BSE的起源是散发的，那么脑内攻毒将是研究病原分布的一个合适替代；如果是通过食入感染性物质引起的，那么口服感染更适合研究病原分布。

到目前为止，还没有全面的关于牛非典型BSE发病机理的资料，有一些通过脑内攻毒途径实验性攻毒感染牛H-BSE和 L-BSE病原外周分布的数据，实验研究中所有的牛都能表现临床症状。目前还没有得到非典型BSE口服感染牛的结果。2008年1月开始进行了L-BSE脑组织匀浆口服感染牛的研究，但目前还没有传染性和感染性分布的结果［13］。由于田间病例绝大多数都是主动监测发现的，这也大大限制了自然病例组织分布数据的获得，这类数据只有L-BSE有。

5　非典型BSE传染实验动物模型研究

将BSE实验性地传染给其他动物，既可研究BSE流行期间对其他动物的危害，也可找到一种实验动物通过朊病毒动物模型进行传代，从而根据发病动物的临床表现和组织病理学特征来鉴定朊病毒毒株的特征。L-BSE和 H-BSE的病原都能通过攻毒实验在其他动物中繁殖。L-BSE的易感宿主广泛，可以在小鼠、绵羊、田鼠、灵长类动物和仓鼠中传播，也可以在表达异种的也就是非牛PrP序列的转基因小鼠中传播；H-BSE可以传播给野生型小鼠、表达牛PrP的转基因小鼠、表达羊PrP的转基因小鼠和表达仓鼠PrP的转基因小鼠［14］，还没有研究证明H-BSE能感染羊、仓鼠或表达人PrP的转基因小鼠。

通过给ARQ/ARQ绵羊（该基因型羊对羊痒病较敏感）和表达绵羊PrPc的转基因小鼠脑内注射L-BSE分离株，证明了L-BSE可以在绵羊体内增殖。L-BSE在绵羊体内的增值导致了一种性状不同于C-BSE的TSE［15］。L-BSE分离株能感染表达绵羊PrPc的转基因小鼠［5］或近交野生型小鼠系［16］，而获得一种与BSE病原难以区分的表型。然而，采集接种C-BSE和L-BSE的过量表达绵羊PrPc的小鼠的组织，再次接种表达牛PrPc的转基因小鼠产生了两种对每个病原特异的不同表型。这表明尽管病原经过表达绵羊PrPc的小鼠的传代在脑中产生了相似的特征，但实际上是不同的。

有报道将来自法国和波兰的H-BSE分离株感染表达牛PrP的转基因小鼠，有相当比例的接种两个不同分离株（一个来自法国，一个来自波兰）的小鼠出现了C-BSE特征［17］。Baron 等［18］也观察到在接种H-BSE的传统野生型小鼠中出现与C-BSE相同的株特征。日本学者将H-BSE分离株感染表达牛PrP的转基因小鼠后，发现有几只小鼠的潜伏期较短，且出现了一种新型的BSE，表现与H-BSE和其它已知BSE株不同的临床症状、脑病理变化和朊病毒蛋白轮廓（profi le），这表明牛中的H-BSE株经过跨种属传播会导致新型的BSE出现［19］。综合这些资料表明非典型BSE和典型BSE有病原学关系，典型BSE病原株也可能是从H型非典型病原株进化而来。

用L-BSE牛的脑组织脑内接种食蟹猴（Cynomolgus macaques）产生了一种在各个方面（临床、病理、生物化学）都和C-BSE不同的海绵状脑病［20］。首先，L-BSE的潜伏期（23～25个月）比C-BSE的潜伏期（38～40个月）短，表明L-BSE感染灵长类的毒力比C-BSE强。L-BSE也能感染倭狐猴（Microcebus murinus），潜伏期比C-BSE短［21］。L-BSE还能通过脑内和口服途径成功感染另一种灵长类模型猕猴（Mouse lemurs），口服感染后，潜伏期变长，临床症状不严重［22］。

组织学和生物化学研究表明L-BSE接种的恒河猴和MM2型散发性克雅氏病病人相似，感染的灵长类和这些罕见的散发性克雅氏病病人表现相同的病损特征，疾病特异的PrP相同的N段都易被蛋白酶消化。接种MM2型散发性克雅氏病病人脑组织的恒河猴和感染L-BSE的恒河猴显示同样的病变［20］。同样，L-BSE传播河堤田鼠后的型特征（潜伏期、PrPSc的生化特征和空泡病变）和VV2散发性克雅氏病感染田鼠后的型特征也难以区分［15］。将L-BSE田间分离株脑内接种两种过度表达人PrP（Met129）的转基因小鼠系后表现的分子型特征和C-BSE接种后表现的分子型特征也不同［23-24］。其中一种L-BSE增殖后明显没有种间传播障碍，第一次传代就100%的侵袭率，后来的传代中潜伏期并没有缩短，L-BSE的PrPSc的生化特征根本未变，和MM2型散发性克雅氏病病人感染这些小鼠后观察到的特征无法分辨。根据临床症状和脑中的抗蛋白酶的朊病毒蛋白（PrPres）的出现［25］，L-BSE的这些传播感染特点和C-BSE对这些小鼠［23］或其他的表达人PrP转基因小鼠［7］的低传播效能显著不同。

H-BSE分离株不能感染表达人PrP的小鼠，表明H-BSE可能很难突破从牛到人的传播屏障［23］。

6　田间病例的组织感染性分布和攻毒牛的传染性研究

在组织感染性分布方面，不论H-BSE还是L-BSE，都在中枢神经组织、外周神经节和神经、肌肉（主要是肌梭）、肾上腺和视网膜等部位检测到了致病型的PrPsc，这与典型BSE的分布一致。与典型BSE不同的是，目前在H-BSE和L-BSE感染牛的淋巴组织和胃肠组织未检测到PrPsc出现。

有多个不同的研究所将两种非典型BSE通过脑内接种牛进行了传染性研究。Suardi等［26］报道了L-BSE攻毒牛后外周肌肉样品中出现BSE感染性和PrPsc沉积。用日本的第一例L-BSE分离株脑内攻毒5头牛，蛋白免疫印迹表明许多外周神经组织含有PrPsc，而来自淋巴网状内皮组织的样品检测为阴性［27］。研究组同样用加拿大的H-BSE分离株对3头牛进行脑内接种，和L-BSE一样，不同的外周神经组织也检测到了PrPsc［28］。在另外一个脑内注射攻毒实验中，5头牛接种L-BSE、6头牛接种H-BSE，那些过去描述的C-BSE局限地检测到感染性的中枢神经组织在这些牛中也得到确认［29］。2012年，Konold等［12］进行了两种非典型BSE脑内攻毒的研究，除在脑、脊髓、回肠末端、三叉神经节、咽后淋巴结、腭扁桃体、肠系膜淋巴结发现PrPSc的沉积外，在三头肌肌梭和眼外肌也发现有PrPSc的沉积。2014年，Konold等［30］用非典型BSE病原二次传代感染牛，发现接种16.5～19.5个月后4头牛表现站立困难，1头牛有瘙痒反应，另外3头牛感觉迟钝，在4头牛脑部都检测到朊病毒且朊病毒的致病型和分子型保持不变。

7　结论

由于各国对BSE病例的持续性分型工作的进展差异较大，所以目前有关非典型 BSE的流行和地理分布的资料是不全面的。检测到的所有非典型BSE病例是通过主动监测发现的，特别是8岁以上的牛，从2001年到2013年每年检测到的病例数相近。目前有些国家停止对健康屠宰牛进行BSE检测，这将导致监测系统失去检测到非典型BSE的能力。现行的采样和快速检测程序，在检测非典型BSE方面还没有正式的评估，这些程序可能对非典型BSE流行现状的监测能力有限。通过田间病例和传播感染实验来研究非典型BSE的致病机理和组织分布的资料还不全面，实验性传播感染研究仅限于将非典型BSE通过脑内接种途径感染牛。对于传播性感染实验，如果非典型BSE的起源是散发的，那么脑内攻毒将是研究病原分布的一个合适替代；如果是通过食入感染性物质而引起，那么口服感染更适合研究病原分布。由于缺乏有关非典型BSE感染牛感染性组织分布的信息，还不能判断目前的特殊风险物质（SRM）名单是否能从牛胴体中去除大多数非典型BSE 感染性，目前的SRM名单是根据典型BSE的致病机理和感染性分布数据制定的。像C-BSE那样，非典型BSE病原都能够通过攻毒实验在其他动物体内繁殖，如小鼠、绵羊、田鼠、灵长类动物、仓鼠、表达异种的（即非牛PrP序列的）转基因小鼠。

非典型BSE流行率很低，但全世界所有的牛都有发病的可能性，即使是BSE风险可忽略国家也不能排除。因此，养牛大国应重新评估本国的BSE监测体系，尤其是目标监测群和检测方法的适用性。同时，由于有些非典型BSE病原（L型）的感染力比典型BSE病原还强，且有可能跨种属传播，因此除BSE风险可控和BSE风险不确定国家对特殊风险物质（SRM）严格限制外，BSE风险可忽略国家也应该对SRM进行限制，以减少动物和人类暴露非典型BSE的风险。尽管目前仍然不清楚非典型BSE的起源和传播方式，但是现行的防控措施，如在加工环节有效去除SRM和反刍动物饲料禁令等，同样可以有效地控制非典型BSE的传播。

［1］ Biacabe A G，Laplanche J L，Ryder S，et al. Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases［J］. EMBO reports，2004（5）：110-115.

［2］ Buschmann A，Gretzschel A，Biacabe A G，et al. Atypical BSE in Germany--proof of transmissibility and biochemical characterization［J］. Veterinary microbiology，2006（117）：103-116.

［3］ Casalone C，Zanusso G，Acutis P，et al. Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy：molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004（10）：3065-3070.

［4］ Beringue V，Bencsik A，Le Dur A，et al. Isolation from cattle of a prion strain distinct from that causing bovine spongiform encephalopathy［J］. Plos pathogens，2006（2）：e112.

［5］ Beringue V，Andreoletti O，Le Dur A，et al. A bovine prion acquires an epidemic bovine spongiform encephalopathy strain-like phenotype on interspecies transmission［J］. The Journal of neuroscience：the offi cial journal of the Society for Neuroscience，2007（27）：6965-6971.

［6］ Yamakawa Y，Hagiwara K，Nohtomi K，et al. Atypical proteinase K-resistant prion protein（PrPres）observed in an apparently healthy 23-month-old Holstein steer［J］. Japanese journal of infectious diseases，2003（56）：221-222.

［7］ Wilson R，Hart P，Piccardo P，et al. Bovine PrP expression levels in transgenic mice influence transmission characteristics of atypical bovine spongiform encephalopathy［J］. The Journal of general virology，2012（93）：1132-1140.

［8］ Biacabe A G，Morignat E，Vulin J，et al. Atypical bovine spongiform encephalopathies，France，2001-2007［J］. Emerging infectious diseases，2008（14）：298-300.

［9］ Guldimann C，Gsponer M，Drogemuller C，et al. Atypical H-type bovine spongiform encephalopathy in a cow born after the reinforced feed ban on meat-and-bone meal in Europe［J］. Journal of clinical microbiology，2012（50）：4171-4174.

［10］ Meloni D，Davidse A，Langeveld J P，et al. EU-approved rapid tests for bovine spongiform encephalopathy detect atypical forms：a study for their sensitivities［J］. Plos one，2012（7）：e43133.

［11］ Wells G A，Konold T，Arnold M E，et al. Bovine spongiform encephalopathy：the effect of oral exposure dose on attack rate and incubation period in cattle［J］. The Journal of general virology，2007（88）：1363-1373.

［12］ Konold T，Bone G E，Clifford D，et al. Experimental H-type and L-type bovine spongiform encephalopathy in cattle：observation of two clinical syndromes a nd diagnostic challenges［J］. BMC veterinary research，2012（8）：22.

［13］ Panelli S，Strozzi F，Capoferri R，et al. Analysis of gene expression in white blood cells of cattle orally challenged with bovine amyloidotic spongiform encephalopathy［J］. Journal of toxicology and environmental health Part A，2011（74）：96-102.

［14］ Okada H，Masujin K，Miyazawa K，et al. Transmissibility of H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy to Hamster PrP Transgenic Mice［J］. Plos one，2010（10）：e0138977.

［15］ Nicot S，Bencsik A，Migliore S，et al. L-type bovine spongiform encephalopathy in genetically suscept ible and resistant sheep：changes in prion strain or phenotypic plasticity of the disease-associated prion protein［J］. The Journal of infectious diseases，2014（209）：950-959.

［16］ Capobianco R，Casalone C，Suardi S，et al. Conversion of the BASE prion strain into the BSE strain：the origin of BSE［J］. Plos pathogens，2007（3）：e31.

［17］ Torres J M，Andreoletti O，Lacroux C，et al. Classical bovine spongiform encephalopathy by transmission of H-typeprion in homologous prion protein context［J］. Emerging infectious diseases，2011（17）：1636-1644.

［18］ Baron T，Vulin J，Biacabe A G，et al. Emergence of classical BSE strain properties during serial passages of H-BSE in wild-type mice［J］. Plos one，2011（6）：e15839.

［19］ Masujin K，Okada H，Miyazawa K，et al. Emergence of a novel bovine spongiform encephalopathy（BSE）prion from an atypical H-type BSE［J］. Scientific Reports，2016（6）：22753.

［20］ Comoy E E，Casalone C，Lescoutra-Etchegaray N，et al. Atypical BSE（BASE）transmitted from asymptomatic aging cattle to a primate［J］. Plos one，2008（3）：e3017.

［21］ Baron T B，Rouland S，Verdier J M，et al. Transmission of atypical BSE to Microcebus murinus，a non-human primate：development of clinical symptoms and tissue distribution of PrPres［J］. Proteins-structure Function & Bioinformatics，2014，82（7）：1542-1548.

［22］ Mestre-Frances N，Nicot S，Rouland S，et al. Oral transmission of L-type bovine spongiform encephalopathy in primate model［J］. Emerging infectious diseases，2012（18）：142-145.

［23］ Beringue V，Herzog L，Reine F，et al. Transmission of atypical bovine prions to mice transgenic for human prion protein［J］. Emerging infectious diseases，2008（14）：1898-1901.

［24］ Kong Q，Zheng M，Casalone C，et al. Evaluation of the human transmission risk of an atypical bovine spongiform encephalopathy prion strain［J］. Journal of virology，2008（82）：3697-3701.

［25］ Beringue V，Herzog L，Jaumain E，et al. Facilitated cross-species transmission of prions in extraneural tissue［J］. Science，2012（335）：472-475.

［26］ Suardi S，Vimercati C，Casalone C，et al. Infectivity in skeletal muscle of cattle with atypical bovine spongiform encephalopathy［J］. Plos one，2012（7）：e31449.

［27］ I wamaru Y，Imamura M，Matsuura Y，et al. Accumulation of L-type bovine prions in peripheral nerve tissues［J］. Emerging infectious diseases，2010（1 6）：1151-1154.

［28］ Okada H，Iwamaru Y，Imamura M，et al. Experimental H-type bovine spongiform encephalopathy characterized by plaques and glial- and stellate-type prion protein deposits［J］. Veterinary research，2011（42）：79.

［29］ Balkema-Buschmann A，Ziegler U，McIntyre L，et al. Experimental challenge of cattle with German atypical bovine spongiform encephalopathy（BSE）isolates［J］. Journal of toxicology and environmental health Part A，2011（74）：103-109.

［30］ Konold T，Phelan L，Cl ifford D，et al. The pathological and molecular but not clinical phenotypes are maintained after second passage of experimental atypical bovine spongiform encephalopathy in cattle［J］. BMC veterinary research，2014（10）：1-9.

（责任编辑：杜宪）

Research Progress on Atypical Bovine Spongiform Encephalopathy

Li Yanxin，Ma Guiping，Liu Quanguo，Shi Xiju，Li Bingling，Xu Liwei
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026）

Atypical bovine spongiform encephalopathy（BSE）is a prion disease of usually older cattle that is distinct from classical BSE by its pathological，molecular and biological phenotype. In order to raise awareness of the disease and to provide the related authorities of our country with scientifi c bases for the prevention and control of this disease，the latest research progress in the aspects of etiology，epidemiology，detection of infection，pathogenesis，transmission studies in animal models of t he disease were summrized in this review.

atypical bovine spongiform encephalopathy；epidemiology；detection；pathogenesis；transmission

S851.3

A

1005-944X（2016）11-0056-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.017

马贵平