肺癌组织中miRNA-34a表达对肺癌细胞系A549增殖和迁移的影响

王崇宇　刘苗生

(舟山旅游与健康职业学院基础医学教研室，浙江　舟山　316111)



肺癌组织中miRNA-34a表达对肺癌细胞系A549增殖和迁移的影响

王崇宇刘苗生

(舟山旅游与健康职业学院基础医学教研室，浙江舟山316111)

〔摘要〕目的探讨肺癌组织中微小RNA(miR)-34a的表达情况及其对肺癌细胞系A549增殖和迁移的影响。方法RT-PCR方法检测miR-34a在肺癌组织和肺癌细胞系A549中的表达情况。克隆形成实验检测miR-34a对肺癌细胞系A549增殖能力的影响；划痕实验检测miR-34a对肺癌细胞系A549迁移能力的影响。TargetScans软件预测miR-34a可能的靶基因，并采用荧光素酶报告基因实验验证预测的靶基因。Western印迹方法检测miR-34a对预测靶基因表达的影响。结果miR-34a在肺癌组织和肺癌细胞系A549中的表达较正常组织显著降低(P<0.01)。转染miR-34a可显著抑制A549细胞的增殖和迁移能力(P<0.01)，而转染miR-34a 抑制剂可增加A549细胞的增殖和迁移能力(P<0.01)。Target Scans软件预测miR-34a可能的靶基因为B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)，且得到荧光素报告实验结果证实。Western印迹结果显示转染miR-34a可显著抑制A549细胞中Bcl-2的表达(P<0.01)，而转染miR-34a 抑制剂可增加A549细胞中Bcl-2的表达(P<0.01)。结论miR-34a可通过调节Bcl-2的表达而发挥肺癌抑制作用。

〔关键词〕肺癌；miR-34a；靶基因；Bcl-2

第一作者：王崇宇(1960-)，女，副教授，主要从事肿瘤病理研究。

80%的肺癌均为非小细胞肺癌(NSCLC)〔1〕。据此，NSCLC的发生发展情况可在一定的过程度上反映肺癌的发生发展情况。NSCLC的发生不仅与p53、Rb和Ras等蛋白质基因编码异常有关〔2〕，还与多种微小RNA(miRNA)表达异常有关〔3〕。miR-34a已证实在多种肿瘤组织中存在异常表达，且与多种肿瘤的发生发展密切相关〔4～6〕。然而，关于miR-34a调节NSCLC发生发展的机制目前尚不清楚。本研究检测miR-34a对B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白表达水平的影响，旨在探讨miR-34a在NSCLC进展中的作用及相关机制。

1资料与方法

1.1临床资料收集2011年6月至2013年12月我院胸科收治的NSCLC患者40例。术前均未接受化疗和放疗。年龄53～76岁〔平均(64.15±6.69)〕岁。NSCLS组织标本取自手术切除的原发肿瘤组织，同时收集切缘附近正常组织作为实验对照。正常组织需于术后经病理医生证实无癌组织侵犯。

1.2细胞及主要试剂NSCLC细胞系A549细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，A549培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中。RPMI1640培养基及胎牛血清购自Gibco公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自Santa Cruz公司；转染试剂购自Lonza公司；TRIzol、miR-34a、阴性对照(NC)、anti-miR-NC和anti-miR-34a购自美国Invitrogen公司，SYBR Green PCR试剂盒购自Ambion公司；荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；Bcl-2抗体购自美国Abcam公司。

1.3荧光定量PCRTrizol提取A549总RNA，反转录成cDNA。PCR反应条件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，共40个循环。引物序列：miR-34a上游引物：5'-CCCACATTTCCTTCTTATCAACAG-3'，下游引物：5'-GGCATCTCTCGCTTCATCTT-3'；内参照U6上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',下游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。得到的数据通过比较CT值法(2-△△Ct)进行定量分析。

1.4方法(1)克隆形成实验：转染miR-34a、NC、anti-miR-NC和anti-miR-34a的A549细胞各5×103接种于6孔板中，培养72 h后，形成的克隆用甲醇固定，并用含0.1%结晶紫的20%甲醇染色30 min，计数形成的克隆数。(2)伤口愈合实验：通过伤口愈合实验方法检测miR-34a对A549细胞迁移能力，详细步骤参见文献报道〔7〕。(3)生物信息学方法预测miR-34a靶基因：通过Target Scans靶基因预测软件筛选出Bcl-2作为miR-34a的靶基因。(4)荧光素酶报告基因验证靶基因：严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5统计学方法用SPSS15.0软件行ANOVA分析和t检验。

2结果

2.1miR-34a在肺癌组织和细胞系的表达miR-34a在肺癌组织的表达量较正常组织相比显著降低(P<0.05)；且miR-34a在肺癌细胞系A549中的表达量亦显著降低(P<0.05)。

2.2miR-34a对A549细胞增殖和迁移的影响转染miR-34a可显著抑制A549细胞的克隆形成能力(P<0.05)，而转染anti-miR-34a可显著增加A549细胞的克隆形成能力(P<0.05)。转染miR-34a可显著抑制A549细胞的迁移能力(P<0.05)，而转染anti-miR-34a可显著增加A549细胞的迁移能力(P<0.05)。见图1。

图1　miR-34a对A549细胞增殖和迁移能力的影响

2.3miR-34a靶基因预测TargetScans靶基因预测软件提示Bcl-2可能是miR-34a的靶基因，且为感兴趣的基因。miR-34a预测结合的Bcl-2 3'-UTR靶位点如图2。共转染野生型pMIR-Bcl-2 3’-UTR载体和miR-34a后，荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，而共转染突变型pMIR-Bcl-2 3’-UTR载体和miRNA-34a的荧光素酶活性未出现显著性改变。

图2　TargetScans靶基因预测软件预测miR-34a靶基因

2.4miR-34a与Bcl-2表达相关性转染miR-34a可显著抑制A549细胞中Bcl-2的表达(P<0.05)，而转染anti-miR-34a可显著增加A549细胞中Bcl-2的表达(P<0.05)。见图3。

图3　Western印迹检测Bcl-2表达

3讨论

miRNA是一类小的非编码RNAs，长度约为19～25个核苷酸。miRNA可在转录后水平对基因的表达进行负调控。miR在许多生物过程，包括发育、分化、凋亡、代谢、免疫和肿瘤进展中均具有重要的作用。近年来，许多研究表明miR在人类癌症的进展中具有重要的作用〔8，9〕。在胶质瘤中，miR-34a可通过调控Akt和Wnt信号通路而调控胶质瘤细胞的增殖和生长〔4〕；在骨肉瘤中，miR-34a已证实可通过调控骨肉瘤细胞的增殖和迁移而参与骨肉瘤的发生和发展〔5〕。本研究提示，miR-34a具有抑制肺癌发生和发展的作用。该结果与文献报道〔6〕的miR-34a与NSCLC发生发展相关的结果一致。然而，关于miR-34a抑制NSCLC发生发展的相关机制目前尚未完全研究清楚。

miRNAs主要通过调节下游靶基因而发挥生物学效应，因此下游作用的靶基因决定了miRNAs 的作用。Bcl-2基因是一种原癌基因，已知与内在凋亡途径密切相关〔10〕。Bcl-2蛋白根据功能不同主要分为抑制凋亡作用和促进凋亡作用〔11〕。此外Bcl-2还证实与肿瘤细胞增殖密切相关〔12〕。本研究结果提示，Bcl-2为miR-34a的功能性靶基因。

综上所述，miR-34a可通过调节Bcl-2的表达情况而抑制NSCLC细胞系A549的增殖和迁移。在NSCLC治疗中，miR-34a可作为一种潜在的治疗靶点。

4参考文献

1权琳，王毅，徐玲，等.非小细胞肺癌患者外周血循环内皮细胞表达的临床价值探讨〔J〕.南京医科大学学报，2014;34(9)：1228-31.

2Toyooka S,Mitsudomi T,Soh J,etal.Molecular oncology of lung cancer〔J〕.Gen Thorac Cardiovasc Surg,2011;59(8):527-37.

3Calin GA,Sevignani C,Dumitru CD,etal.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2004;101(9):2999-3004.

4Rathod SS,Rani SB,Khan M,etal.Tumor suppressive miRNA-34a suppresses cell proliferation and tumor growth of glioma stem cells by targeting Akt and Wnt signaling pathways〔J〕.FEBS Open Bio,2014;4(5):485-95.

5Lv H,Pei J,Liu H,etal.A polymorphism site in the pre-miR-34a coding region reduces miR-34a expression and promotes osteosarcoma cell proliferation and migration〔J〕.Mol Med Rep,2014;10(6):2912-6.

6Shi Y,Liu C,Liu X,etal.The microRNA miR-34a inhibits non-small cell lung cancer(NSCLC) growth and the CD44hi stem-like NSCLC cells〔J〕.PLoS One,2014;9(3):e90022.

7Xu LF,Wu ZP,Chen Y,etal.MicroRNA-21(miR-21) regulates cellular proliferation,invasion,migration,and apoptosis by targeting PTEN,RECK and Bcl-2 in lung squamous carcinoma,Gejiu City,China〔J〕.PLoS One,2014;9(8):e103698.

8Joshi HP,Subramanian IV,Schnettler EK,etal.Dynamin 2 along with microRNA-199a reciprocally regulate hypoxia-inducible factors and ovarian cancer metastasis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2014;111(14):5331-6.

9Xie K,Liu J,Chen J,etal.Methylation associated silencing of microRNA-34b in hepatocellular carcinoma cancer〔J〕.Gene,2014;543(1):101-7.

10Thomas HE,McKenzie MD,Angstetra E,etal.Beta cell apoptosis in diabetes〔J〕.Apoptosis,2009;14(12):1389-404.

11Lupi R,Dotta F,Marselli L,etal.Prolonged exposure to free fatty acids has cytostatic and pro-apoptotic effects on human pancreatic islets:evidence that beta-cell death is caspase mediated,partially dependent on ceramide pathway,and Bcl-2 regulated〔J〕.Diabetes,2002;51(5):1437-42.

12李扩，许秋然，刘欣，等.miR-204通过下调Bcl-2和Sirt1表达抑制肝癌细胞生长〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2015;31(2):168-72.

〔2015-04-15修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：刘苗生(1958-)，男，硕士，主任医师，副教授，主要从事临床肿瘤治疗研究。

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6446-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.062