同种移植小鼠乳腺癌超声造影增强模式与缺氧诱导因子1α的相关性

王　铭，冯海凉，刘　赫，姜玉新，刘玉琴，朱庆莉，戴　晴，李建初，李康宁

1中国医学科学院　北京协和医学院　北京协和医院超声诊断科，北京 100730

2中国医学科学院　北京协和医学院　基础医学研究所细胞资源中心，北京 100005



同种移植小鼠乳腺癌超声造影增强模式与缺氧诱导因子1α的相关性

王铭1，冯海凉2，刘赫1，姜玉新1，刘玉琴2，朱庆莉1，戴晴1，李建初1，李康宁1

1中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院超声诊断科，北京 100730

2中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所细胞资源中心，北京 100005

刘玉琴电话：010- 69156473，电子邮件：liuyuqin@pumc.edu.cn

摘要：目的探讨乳腺癌超声造影(CEUS)增强模式与缺氧诱导因子1α(HIF- 1α)表达及微血管密度(MVD)的关系。方法在22只小鼠体内建立同种移植性乳腺癌，于接种后第4、6、7、8、9、10、11天随机抓取3～4只小鼠进行常规超声及CEUS检查，检查结束后处死小鼠并使用免疫组织化学方法检测肿瘤标本中HIF- 1α表达及 MVD，分析CEUS增强模式与HIF- 1α表达及MVD的关系。结果22只小鼠乳腺癌中瘤体<0.05 cm3组5例，CEUS表现为Ⅰ型增强模式，周边环状增强，内部无增强4例，Ⅱ型增强模式，周边环状增强并向病灶内呈点线状穿入1例；0.05～0.75 cm3组9例，多表现为Ⅲ型增强模式，病灶弥漫性增强，均匀/不均匀5例；>0.75 cm3组8例，多表现为Ⅳ型增强模式，周边环状增强，内部结节状增强7例。3组瘤体在CEUS增强模式上差异有统计学意义(P<0.01)，Ⅰ～Ⅳ型CEUS增强模式与肿瘤大小相关(r=0.841，P<0.05)。小鼠乳腺癌中HIF- 1α表达与增强模式(Ⅰ～Ⅳ型)呈负相关(r=-0.596，P=0.003)，与肿瘤大小无相关性(P>0.05)。Ⅰ～Ⅳ型CEUS增强模式间MVD均值差异无统计学意义，MVD与肿瘤大小无相关性(P>0.05)。结论CEUS可动态评估同种移植性小鼠乳腺癌的血管生成，肿瘤增强模式与肿瘤HIF- 1α的表达水平相关。

关键词：乳腺癌；同种移植动物模型；超声造影；缺氧诱导因子1α；肿瘤血管生成

Effects of Rapamycin and Rapamycin-loaded Poly(lactic-co-glycolic)Acid Nanoparticles on Apoptosis and Expression of bcl- 2 and p27kip1Proteins of Human Umbilical Arterial Vascular Smooth Muscle Cell Correlation of Contrast-enhanced Ultrasound with Expression of Hypoxia Inducible Factor- 1α in Transplanted Mice Mammary Cancer

ActaAcadMedSin，2015,37(6)：656-661

乳腺癌是一种血管依赖性肿瘤，肿瘤生长至1～2 mm3时即需新生血管的形成[1]。缺氧诱导因子- 1α(hypoxia inducible factor- 1α，HIF- 1α)是恶性肿瘤细胞在缺氧条件下产生的具有转录活性的核蛋白，启动血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，与肿瘤血管生成密切相关，并与乳腺癌预后、疗效评估有关[2- 4]，因此，监测HIF- 1α在实体肿瘤中的活性在临床中具有重要价值[3，5]。超声造影微血管显像可实时动态显示活体肿瘤的血流灌注及血流动力学状态。本研究借助小鼠乳腺癌移植瘤模型探讨超声造影(contrast-enhanced ultrasound，CEUS)对乳腺癌新生血管的动态评估价值，以及CEUS与HIF- 1α表达状态之间的关系。

材料和方法

实验动物和材料雌性615系小鼠22只，6周龄，体重16～18 g，购自天津血液研究所实验动物中心[合格证号：SCXK(津)2009- 0002]。615系小鼠乳腺癌Ca761瘤株，由国家实验细胞资源共享平台中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心提供。抗小鼠HIF- 1α单克隆抗体(ab463)、兔抗小鼠CD34单克隆抗体(ab81289)购自Abcam公司。辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自北京中山金桥公司。

同种移植小鼠乳腺癌模型的建立液氮下复苏Ca761/L冻存细胞，细胞悬液法接种于615系荷瘤种鼠右腋下，2～3周后分离剥取肿瘤组织，制作成肿瘤细胞悬液，接种于615系小鼠左臀部皮下，建立同种移植瘤模型，剂量0.1 ml/只，约含瘤细胞2×106个。22只小鼠于种植肿瘤后第4、6、7、8、9、10、11天进行超声检查。每天挑选3～4只小鼠进行实验，麻醉脱毛，暴露左臀部移植瘤，进行常规超声及CEUS检查，CEUS结束后处死小鼠获取病理标本。实验流程中严格遵循实验动物福利和伦理学要求。

检查方法及图像分析采用Philips IU22超声诊断仪，L12- 5线阵探头。乳腺造影设置，脉冲反相谐波成像技术，机械指数调节至0.07，造影总增益设置为70%，深度2.5 cm，单点聚焦置于图像最深部。造影剂为SonoVue。常规超声显示肿瘤，选取最大切面，调节图像至最佳，切换入超声造影模式，胰岛素针抽取造影剂0.05 ml，采用眶后静脉团注法注入小鼠体内，保持最大切面不变，连续实时观察病灶动态灌注过程3 min。

常规超声检查：于肿瘤最大切面上测量肿瘤长径a及前后径b，计算肿瘤体积V=1/2ab2。

超声造影图像分析：根据增强达峰时病灶内造影剂的分布将增强模式分为4型：Ⅰ型：周边环状增强，内部无增强；Ⅱ型：周边环状增强，并向病灶内穿入；Ⅲ型：弥漫性增强，均匀或不均匀；Ⅳ型：周边环状增强，病灶内部结节状增强 (图1)。

HIF- 1α和微血管密度表达情况的检测分离剥取肿瘤组织，沿造影检查切面剖开肿瘤，于切面侧敷贴纸片，将肿瘤组织放于甲醛中固定，石蜡包埋，沿造影切面连续切片，进行HE及免疫组织染色。

结果判定：(1)以CD34标记计数微血管密度(microvessel density，MVD)：在低倍镜(×40)下找到肿瘤组织内血管密集区，即“热点”，然后在高倍镜(×200)下观察，采用Weidner等[6]评判标准，以5个高倍镜视野下毛细血管和微血管的平均值作为该例的MVD值。(2)HIF- 1α：采用半定量计分法判定，细胞核或胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞。按阳性着色程度评分，0分无着色；1分胞浆着色为主；2分：细胞核弱着色；3分：细胞核强着色。按阳性细胞所占比例评分，0分≤5%；1分为6%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。两者乘积判定阳性结果：0级(-)：0分；1级(+)：1～4分；2级(++)：5～8分；3级(+++)：9～12分。其中2～3级为高表达，0～1级为低表达。

统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示。两样本构成比及两变量间关联性采用X2检验及Fisher精确概率法。相关性判断使用相关性分析。两样本均数比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

小鼠乳腺癌超声造影表现建立22只小鼠乳腺癌模型，成瘤率100%。根据肿瘤大小不同分为3组(<0.05 cm3、0.05～0.75 cm3，>0.75 cm3)，经Fisher 确切概率法检验，不同瘤体组CEUS表现差异有统计学意义(P<0.01)，<0.05 cm3瘤体组中Ⅰ型增强模式多见，0.05～0.75 cm3瘤体组中Ⅲ型增强模式多见，>0.75 cm3瘤体组中Ⅳ型增强模式多见(表1)。Spearman相关性分析显示CEUS增强模式(Ⅰ～Ⅳ型)与肿瘤大小呈正相关(r=0.841，P< 0.05)。

小鼠乳腺癌HIF- 1α表达与CEUS增强模式的关系HIF- 1α阳性细胞主要分布于乳腺癌病灶边缘、肿瘤新生血管周围区域，以及坏死肿瘤组织周边。Ⅰ型CEUS增强模式4例，其中HIF- 1α表达2级(++)1例、3级(+++)3例。Ⅱ 型增强模式3例，其中HIF- 1α表达2级(++)2例、3级(+++)1例。Ⅲ 型增强模式6例，其中HIF- 1α表达0级(-)1例、1级(+)2例、2级(++)1例、3级(+++)2例。Ⅳ型增强模式9例，其中HIF- 1α表达0级(-)2例、1级(+)3例、2级(++)4例。经Spearman相关性分析显示HIF- 1α表达状态(-～+++)与 Ⅰ～Ⅳ型增强模式呈负相关(r=-0.596，P=0.003)，与肿瘤大小无相关性(P>0.05)(图2、图3)。

小鼠乳腺癌CD34标记MVD值与CEUS增强模式的关系由于Ⅰ型与Ⅱ型增强模式均以周边增强为主，仅病灶内部血流灌注略有差别，因此将Ⅰ型与Ⅱ型合并统计。(Ⅰ+Ⅱ)型7例，MVD均值(14.4±3.7)个/高倍视野(9～19个/高倍视野)；Ⅲ型6例，MVD均值为(14.5±6.09)个/高倍视野(8～25个/高倍视野)；Ⅳ型9例，MVD均值为(11.0±6.49)个/高倍视野(5～21个/高倍视野)。经单因素方差分析，不同CEUS增强模式下MVD均值差异无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关性分析显示MVD与肿瘤大小无关(P>0.05)(图2、图3)。

CEUS：超声造影

CEUS：contrast-enhanced ultrasound

A. Ⅰ型：周边环状增强，内部无增强；B. Ⅱ型：周边环状增强，并向病灶内穿入；C. Ⅲ型：弥漫性增强，均匀或不均匀；D. Ⅳ型：周边环状增强，病灶内部结节状增强

A. type Ⅰ：peripheral ring enhancement with no enhancement within the tumor；B. type Ⅱ：peripheral ring enhancement with deep penetration；C. type Ⅲ：homogeneous or heterogeneous enhancement；D. type Ⅳ：peripheral ring enhancement with focal nodular enhancement within the tumor

图 1CEUS增强模式分型

Fig 1Classification of contrast-enhanced patterns of ultrasound

表 1　22例小鼠乳腺癌的CEUS表现[n(%)]

经Fisher 确切概率法检验，3组瘤体在CEUS增强模式上差异有统计学意义(P<0.01)

Contrast-enhanced pattern was significantly different in different volume groups (P<0.01)(Fisher’s test)

HIF- 1α：缺氧诱导因子- 1α；MVD：微血管密度

HIF- 1α：hypoxiainducible factor- 1α;MVD：microvessel density

A. 灰阶超声显示肿瘤大小1.4 cm×0.7 cm；B. CEUS增强模式表现为Ⅲ型，非均匀性弥漫性增强；C.HIF- 1α表达为1级(棕褐色细胞为阳性细胞)(免疫组织化学染色，×400)；D. CD34标记的MVD，平均MVD计数7个/高倍视野(×200)

A. the gray-scale ultrasound showed the tumor size was 1.4 cm×0.7 cm；B.the contrast-enhanced pattern presented as type Ⅲ，showing heterogeneous enhancement；C. staining of HIF- 1α presented as grade 1(sepia cell showed the positive cell) (immunohistochemistry，×400)；D. the mean value of MVD was 7 at 200× magnification marked with CD34(×200)

图 2小鼠乳腺癌种植后第8天超声表现及免疫组织化学染色

Fig 2Ultrasonography and immunohistochemical staining of mice breast cancer 8 days after implantation

A. 灰阶超声显示肿瘤大小1.9 cm×1.2 cm；B. CEUS增强模式表现为Ⅳ型，即肿瘤周边环状增强，病灶内部结节状增强；C.HIF- 1α表达为1级(棕褐色细胞为阳性细胞)(免疫组织化学染色，×400)；D. CD34标记的MVD，计数MVD均值6个/高倍视野(×200)

A. the gray-scale ultrasound showed the tumor size was 1.9 cm ×1.2 cm；B. the contrast-enhanced pattern presented as type Ⅳ，peripheral ring enhancement with focal nodular enhancement within the tumor；C. staining of HIF- 1α presented as grade 1(sepia cell showed the positive cell) (immunohistochemistry，×400)；D. the mean value of MVD was 6 at 200×magnification marked with CD34(×200)

图 3小鼠乳腺癌肿瘤种植后第11天超声表现及免疫组织化学染色

Fig 3Ultrasonography and immunohistochemical staining of mice breast cancer 11 days after implantation

小鼠乳腺癌HIF- 1α表达与MVD的关系22例小鼠乳腺癌中14例HIF- 1α呈高表达(++～+++)，其MVD均值为(16.14±4.24)个/高倍视野；8例HIF- 1α呈低表达(-～+)，MVD均值为(11.13±4.32)个/高倍视野。经t检验显示小鼠乳腺癌HIF- 1α高表达组中MVD 均值大于HIF- 1α低表达组MVD 均值(t=-2.652，P<0.05)。

讨论

肿瘤的生长、侵袭、转移与新生血管密切相关[7- 8]，MVD计数是临床评估血管生成的常用方法。彩色多普勒血流显像能显示直径≥200 μm的血管，但不能显示低流速的血流(<1 mm/s)，对较小乳腺癌的血流显示欠佳[9]。CEUS可以显示直径<4 μm的血管，清晰显示肿瘤血流灌注，血管的走形、分布，可作为评估肿瘤血管生成的可靠方法。

本研究利用小鼠移植瘤模型，观察生长不同时间、不同体积肿瘤的CEUS增强模式，总结出较小肿瘤的4型CEUS增强模式，肿瘤体积较小(<0.05 cm3)时肿瘤内部多呈点线状增强，随着肿瘤体积的增大，可为整体增强或病灶内部结节状增强，小鼠乳腺癌I～Ⅳ型CEUS增强模式与肿瘤大小密切相关(P<0.05)。本研究结果显示不同CEUS增强模式下(Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)MVD均值差异无统计学意义(P>0.05)。目前关于CEUS增强模式与MVD的报道较少。分析本研究Ⅰ～Ⅳ型增强模式间MVD差异无统计学意义的原因，可能是由于MVD计数仅选择肿瘤新生血管的热区，而CEUS评估整个瘤体血供情况；各增强类型都有周边增强，而周边往往是MVD计数区域，因此CEUS和MVD观察部位不同也许是二者未发现相关性的一个原因。

缺氧诱导因子- 1在肿瘤血管生成、能量代谢肿瘤发展中发挥重要作用[10- 11]。在低氧条件下，其功能亚基HIF- 1α通过增加VEGF的转录活性及增加VEGF mRNA的稳定性促使VEGF表达进而调节肿瘤血管形成[12]，当血供增加，肿瘤氧供丰富时，HIF- 1α分解、降低[13]。本研究显示小鼠乳腺癌HIF- 1α高表达组MVD值大于低表达组MVD值(P<0.05)。CEUS增强模式(Ⅰ～Ⅳ型)与HIF- 1α表达(-～+++)呈负相关(r=-0.596，P=0.003)。目前有关CEUS增强模式与HIF- 1α表达相关性的文献报道较少，而且对于HIF- 1α表达与血流关系的研究尚存在争议[14- 16]。Forsberg等[17]在小鼠肿瘤达到一定大小时(接种肿瘤2周后)进行CEUS，探讨CEUS增强面积与血管生成相关因子表达的关系，结果显示CEUS增强面积与环氧合酶- 2(与肿瘤血管生成相关的因子)表达染色面积呈负相关。Forsberg等[17]认为这可能与肿瘤快速生长阶段微血管向周边移位，以及瘤体内血管容积由于肿瘤的增大和间质压力的增加相对减少有关，也可能与肿瘤内血管生成的异质性有关。

综上，本研究显示实时灰阶CEUS可动态、全面评估肿瘤内血管生成情况，在肿瘤生长过程中HIF- 1α表达状态变化复杂，肿瘤CEUS增强模式可能反映乳腺癌内HIF- 1α表达水平，但结果仍有待于进一步研究。

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·论著·

WANG Ming1，FENG Hai-liang2，LIU He1，JIANG Yu-xin1，LIU Yu-qin2，ZHU Qing-li1，DAI Qing1，LI Jian-chu1，LI Kang-ning1

1Department of Ultrasound，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

2Cell Resource Center，Institute of Basic Medical Science，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China

Corresponding author：JIANG Yu-xinTel：010- 69155491，E-mail：jiangyuxinxh@163.com；

LIU Yu-qinTel：010- 69156473，E-mail：liuyuqin@pumc.edu.cn

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the correlation of contrast-enhanced pattern with expression of hypoxia inducible factor- 1α (HIF- 1α) and microvessel density (MVD) in mice breast cancer.MethodsA total of 22 mice were implanted with breast cancer cells (Ca761) subcutanously in the thigh. The tumors were examined with conventional ultrasound and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) on days 4，6，7，8，9，10，and 11 after implantation and then sacrificed. Three or four mice were included each time. Expressions of HIF- 1α and MVD in cancer tissues were detected immunohistochemically. Correlation of contrast-enhanced patterns with expression of HIF- 1α and MVD in breast cancer was analyzed.ResultsMice were divided into 3 groups according to the tumor volume：group 1 (volume<0.05 cm3，n=5)，group 2 (volume 0.05- 0.75 cm3，n=9)，and group 3 (volume>0.75 cm3，n=8). The CEUS pattern was different in different groups：four mice in group 1 presented as type Ⅰ (peripheral ring enhancement with no enhancement within the tumor) and 1 case presented as type Ⅱ (peripheral ring enhancement with deep penetration). Most mice in group 2 presented as type Ⅲ (homogeneous or heterogeneous enhancement in the whole tumor，n=5). In group 3，most mice presented as type Ⅳ (peripheral ring enhancement with focal nodular enhancement within the tumor，n=7). Contrast-enhanced pattern was significantly different in different volume groups (P<0.01). Enhanced pattern (type Ⅰ-Ⅳ) was closely correlated with tumor volume (r=0.841，P<0.05). The expression of HIF- 1α was negatively correlated with enhanced patterns (type Ⅰ-Ⅳ) (r=-0.596，P=0.003)，but not with tumor volume (P>0.05). There was no significant difference in MVD values between different enhanced patterns (type Ⅰ- Ⅳ)，and there was no correlation between the MVD and tumor volumes (P>0.05). ConclusionCEUS can be used as a noninvasive tool to monitor tumor angiogenesis in tumor and the enhanced patterns may reflect the expression of HIF- 1α inside the tumor.

Key words：breast cancer；allograft animal model；contrast-enhanced ultrasound；hypoxia inducible factor- 1α；tumor angiogenesis

收稿日期：(2015- 04- 16)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.06.005

中图分类号:R445.1

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2015)06- 0656- 06

通信作者：姜玉新电话：010- 69155491，电子邮件：jiangyuxinxh@163.com；

基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(20121106130002)Supported by the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (20121106130002)