基于肝干细胞的肝癌生物学研究进展



基于肝干细胞的肝癌生物学研究进展

职晓松，訾晓渊，胡以平

( 第二军医大学 基础部细胞生物学教研室，上海200433)

[摘要]肝干细胞是一类具有自我更新能力和分化为肝细胞与胆管细胞能力的肝原始细胞。而原发性肝癌是我国死亡率居第2位的恶性肿瘤。近年在中晚期肝癌中发现了具有干细胞特性的细胞(即肝癌干细胞)存在，并认为肝癌干细胞自我更新机制的失调可能是原发性肝癌发生的因素之一，这种细胞可能与肝癌细胞增殖的维持、转移、放疗和化疗抵抗等现象有关。本文就肝干细胞和肝癌干细胞在原发性肝癌的发生、转移和治疗抵抗中发挥的作用进行综述。

[关键词]肝干细胞；肝癌干细胞；肝癌；转移；放疗化疗抵抗

肝干细胞目前认为是一类存在于肝门管区Hering管中的肝原始细胞，具有持续的自我更新能力和分化为成熟肝细胞和胆管细胞的能力，主要参与生理性肝脏细胞更新和病理性肝损伤修复。而原发性肝癌在我国已成为死亡率居第2位的恶性肿瘤，具有早期诊断难、进展快、预后差及复发率高等特点。目前认为，限制肝癌研究进展的一个关键因素就是对肝癌生物学行为的细胞学基础认识不清。近年来，有动物实验发现，许多调控肝干细胞自我更新的信号通路失调节会导致肝癌的发生，这为认识肝癌的发病机制提供了新的思路。而许多中晚期肿瘤组织中同样存在一小群能维持肿瘤组织恶性生长的具有干细胞特性的细胞，并定义这群细胞为肿瘤干细胞(或称肿瘤启动细胞)[1]。在肝癌中，同样发现了肝癌干细胞。肝癌干细胞与肝干细胞都具有自我更新和多向分化能力，并表达许多相同的表面标志物，如EpCAM、CK19和CD133[2-4].但是，肝癌干细胞内与细胞生长相关的信号通路通常处于失调节的状态，这造成肝癌干细胞呈现异常的分裂增殖状态并产生畸形的后代细胞[5]。除此以外，肝癌干细胞还可能是肿瘤转移和放疗化疗抵抗的重要原因[6]。准确理解肝干细胞和肝癌干细胞与原发性肝癌生物学行为之间的关系，对肝癌早期诊断和靶向治疗研究有重要的指导意义。

1肝干细胞自我更新失调导致原发性肝癌的发生

肝脏是再生能力很强的内胚层来源的器官，其再生可分为部分肝切除后再生和肝细胞弥漫性损伤后再生。其中部分肝切除后再生主要依赖于成熟肝细胞自身的分裂增殖；而化学药物和嗜肝病毒所造成的肝细胞慢性弥漫性损伤(尤其重型肝损伤)，则主要依赖于门管区增殖的肝干细胞修复再生，这种再生过程称为胆管反应，通常伴随肝脏慢性炎症和肝纤维化，严重增生失调者则形成原发性肝癌。

肿瘤是当今世界危害人类健康的重大疾病之一，其难以攻克的主要原因就是对于肿瘤形成机制不清楚，随着肿瘤干细胞概念的提出，人们逐渐认识到干细胞在肿瘤发生发展中的作用，并陆续在乳腺癌[7]、前列腺癌[8]、黑素瘤[9]和肠癌[10]中发现和鉴别出了相应的肿瘤干细胞，并在肠癌中证实了肠癌干细胞来源于Wnt活化的lgr5+肠隐窝干细胞[10]。肝癌细胞系，肝癌动物模型和人原发性肝癌标本中同样存在表达CD133、CD90、CD44、EpCAM等肿瘤干细胞标志的肝癌干细胞，这群细胞在维持肝癌细胞恶性增殖中发挥了重要作用[5]。但是肝癌干细胞是否来源于肝干细胞仍有争议。

肝干细胞自我更新的维持依赖于多种信号通路的调控，包括Wnt/β-catenin通路、Notch通路、TGF-β通路、EpCAM通路和Hedgehog通路等。而肝癌干细胞中这些通路处于失调节状态，故有人认为，肝干细胞中这些通路的失调可能导致肝干细胞恶性转化，从而成为了潜在的肝癌干细胞。

1.1Wnt/β-catenin通路与肝干细胞恶性转化Wnt/β-catenin通路主要调节细胞增殖、细胞分化、细胞迁徙和细胞凋亡等。遗传因素或表观遗传因素所造成的Wnt通路失调节和许多癌症相关，尤其是肠癌和肝癌。Wang等发现3,5-二乙酯-1,4-二氢三甲吡啶(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine,DDC)处理的乙肝病毒转基因小鼠全部形成肝癌，其肝癌标本中Wnt通路出现明显活化，并从中分选出干细胞标志物EpCAM阳性的细胞进行裸鼠移植实验，证实了这些肝干细胞具有再次成瘤的能力[11]。另有小鼠实验发现当选择性敲除肝细胞β-catenin基因使肝细胞失去增殖能力后，肝门管区出现大量表达肝干细胞表型OV6和EpCAM的β-catenin+的细胞，这些细胞表现出异常活化的增殖能力，并在后期有可能会自发地形成肝细胞癌[12]。这提示当肝细胞增殖能力受损后，肝干细胞成为肝癌发生的起始细胞。近年来，基于Cre-LoxP系统的细胞谱系示踪技术正逐渐地被用于干细胞与肿瘤发生相关性的研究。S. Mokkapati等发现了胚胎期肝干细胞标志物Cited1(一种肝脏转录激活因子)，并构建了Cited1-CreERTM-GFP;β-catemin+/fl小鼠，进而发现，在这种双转基因小鼠的Cited1阳性细胞中的Wnt/β-catenin通路可被选择性地活化，并在26周后发现91%的这种小鼠都有肝癌的发生[13]。这一发现，为肝癌的干细胞来源学说提供了有力证据，同时，也显示了细胞谱系示踪技术在肝干细胞与肝癌发生相关性的研究中的有效性。

1.2Notch通路与肝干细胞恶性转化已有证据表明，Notch通路在胚胎期和成年期干细胞的自我更新和分化过程中起着关键作用。在哺乳动物中，目前已发现4种Notch受体(Notch1～4)，配体与Notch受体结合后会促使Notch受体的胞外和跨膜区释放出Notch受体胞内区(Notch intracellular domain; NICD)，NICD入核后与DNA上的重组信号结合蛋白Jκ(DNA-binding recombination signal-binding protein Jκ; RBP-Jκ)相结合从而启动Notch信号的靶基因转录。在肝脏中，Notch信号主要促使肝干细胞向胆管细胞方向分化而非肝细胞方向分化[14]，Notch通路阻断将导致先天性胆管系统发育不全[15]。临床标本发现，约1/3肝癌(包括肝细胞癌和肝内胆管癌)中可以观察到Notch通路活化，而且Notch通路活化的肝癌通常会同时具备肝细胞癌和胆管细胞癌两种病理学分型，即混合型肝癌(一种肝原始细胞来源的肝癌)[16]。而且，在Alfp-Cre/N1ICD和Alb-Cre/N2ICD双转基因小鼠中，组成型激活胚胎源性肝干细胞(或称肝成纤维细胞)的Notch信号，确实可以诱导肝细胞癌或混合型肝癌的生成[16-17]。在典型的混合型肝癌中，有一小群细胞体积小而均一，呈卵圆形，胞浆少，核染色质深染，存在于典型的肝细胞癌和胆管细胞癌区域之间，同时表达OV-6、CD133、EpCAM和c-kit等干细胞标记，这种过渡区域细胞被认为是混合型肝癌的肝癌干细胞[18]。虽然上述事实提示Notch活化可以促使胚胎源性肝干细胞恶变，但其是否参与成体肝干细胞致癌过程尚无定论。

1.3TGF-β通路与肝干细胞恶性转化TGF-β通路与胚胎期以及成年后细胞更新、分化和凋亡相关，作用方式为TGF-β和膜受体结合，使受体发生磷酸化，Smad2/3蛋白发生核转位与Smad4蛋白形成复合体，从而调节转录过程。TGF-β在肝癌发生发展中具有双向调节作用[19]。人群中，TGF-β先天缺失将导致Beckwith-Wiedemann综合征，一种遗传性干细胞来源的疾病，这种疾病患癌(包括肝癌)风险比正常人要高出800倍[20]。动物实验也证实，β2血影蛋白(TGF-β信号的接头蛋白)缺失的转基因小鼠出现和人类Beckwith-Wiedemann综合征相似的表型如内脏肥大，巨舌，面部畸形等，并在几个月后长出肝癌、胃肠癌和胰腺癌等胃肠道肿瘤[21]。然而，TGF-β过高表达也能诱发肝癌。二甲基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程中，表达持续升高的TGF-β能够使OV6阳性的肝干细胞CD133、CD90和EpCAM等肿瘤干细胞标志物表达同步升高，从而猜测TGF-β可能诱发了肝干细胞恶性转化，之后发现TGF-β处理的WB-F344肝干细胞系能够再植成瘤，从而也验证了这种猜测[22]。

虽然多种证据表明，内外致癌因素诱导的维持肝干细胞自我更新的通路失调节会引起肝干细胞恶性转化，产生异常或畸形的后代细胞，最终诱发肝癌形成。然而，决定肝干细胞恶性转化的信号通路中的关键调控分子及其相互作用机制仍有待于进一步研究。

2肝癌干细胞与转移干细胞

肿瘤转移是指肿瘤细胞从肿瘤原发部位侵袭进入血管、淋巴管或体腔，迁徙到他处而继续生长，最终形成与原发瘤病理类型相同的肿瘤的过程。肝癌极易复发转移，最常发生的是肝内转移，这是肝癌难以根治的一个重要原因。然而，并非所有的肝癌细胞都具备发生转移的能力，癌细胞在迁徙的过程中不仅要逃避自身免疫系统中T细胞，巨噬细胞和NK细胞的杀伤，还要逃避化疗药物的杀伤，因此大量肿瘤细胞(包括肿瘤干细胞)在迁徙过程中死亡[23]。T. Oskarsson于2014年提出了转移干细胞[24]的概念。转移干细胞指的是任何能够在远处形成同种类型的肉眼可见的肿瘤组织的播散性肿瘤细胞。在肝癌中，虽然原发灶中肝癌干细胞和转移灶中一小群细胞(可能是转移干细胞)在表型和功能上具有相似性，但是肝癌中转移干细胞是否来源于肝癌干细胞仍然未知。肝癌中转移干细胞可能有以下两种来源。

2.1肝癌中转移干细胞可能就是存在于原发灶中的肝癌干细胞临床上，人们发现肝癌原发灶中高表达干细胞标志物的患者预后更差，转移发生率更高[25]。在肝脏中，Hedgehog通路在肝干细胞自我更新和肝癌发生发展中均起着重要调节作用，当Hedgehog通路被抑制后，肝癌组织中肝成纤维细胞和CD44阳性肝癌干细胞数量明显减少，肝癌转移灶也相应减少[26]。同样，当在肝癌细胞系HuH-7、Hep3B和HepG2中，以小干扰RNA降低与肝干细胞恶性转化相关的cadherin-17表达时，这些肝癌细胞的再植成瘤能力和转移能力明显减低[27]。这暗示肝癌干细胞可能是肝癌的转移干细胞。然而，最有力的证据证明组织干细胞、肿瘤干细胞和转移干细胞的关系来自于肠腺瘤和肠癌的研究。谱系示踪实验证明，肠隐窝干细胞中大肠腺癌息肉病基因APC选择性敲除后能转化为肿瘤干细胞，维持肠腺瘤的生长。在晚期结肠癌的动物实验中发现，维持原发灶形成的肠癌干细胞和转移灶中干细胞群的基因表达谱是相似的，而且空间位置上都处于腺癌隐窝处[28-29]从而提示了肿瘤干细胞和转移干细胞的谱系一致性。

2.2肝癌中转移干细胞也可能由其他肝癌细胞经上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition; EMT)而来。EMT是胚胎形成的重要过程，尤其在组织迁徙如原肠胚和神经嵴迁徙中发挥重要作用。目前认为，肿瘤转移过程中也存在EMT。一些上皮源性的肿瘤细胞在间质性细胞如成纤维细胞、间充质干细胞、巨噬细胞等分泌的一些细胞因子的刺激下发生EMT，肿瘤细胞间粘附能力下降，迁移能力增强[30]。而且，肿瘤细胞发生EMT过程中可获得干细胞的特征。例如，间质中成纤维细胞分泌的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)能够加强Wnt/β-catenin信号通路，从而诱导分化的结直肠癌细胞发生EMT，并高表达干细胞标志lgr5[31]。此外，乳腺癌的循环肿瘤细胞中已被证实存在能引起骨、肺和肝转移的EpCAM+CD44+CD47+MET+转移干细胞，其中CD44是乳腺癌干细胞的标志物，而MET是HGF受体，预示着细胞发生了EMT[32].这极大地提示了乳腺癌转移干细胞是其他肿瘤细胞经历EMT获得干细胞特性后转化而来。肝癌中，EMT也被认为是肝内和远处转移的中心环节。其中E-cadherin的抑制子Snail和Twist的高表达被认为是肝细胞癌发生EMT的关键过程。E-cadherin的缺失或Snail和Twist蛋白的升高预示着肝癌转移和较差的预后[33]。体外和成瘤实验也证明，肝癌细胞系中过表达Snail和Twist会诱导EMT和肝癌转移；相反，Snail和Twist敲除后，肝癌细胞系则表现出低侵袭性和低转移趋势[34-35]。与乳腺癌相似，可能引起肝癌转移的循环肿瘤细胞中也发现EpCAM+CD133+转移干细胞，同时这些细胞表现出间质细胞表型vimentin+/E-cadherin-[36]。这些事实说明，肝癌细胞可能经历EMT获得干细胞特性，从而促进了肝癌转移。而肿瘤相关巨噬细胞分泌的TGF-β1可能正是启动肝癌EMT过程的关键因素[37]。

3基于肝癌干细胞的肝癌放疗化疗抵抗及靶向治疗

肝癌的中晚期治疗主要依靠放疗和化疗。放化疗虽然短期内能抑制肝癌的生长，但是却不能根除肝癌，即肝癌对放化疗存在治疗抵抗。放疗和化疗通常能够杀死快速增殖的细胞，而对于处于G0期的静息细胞则不具备杀伤效果。肝癌中肝癌干细胞多数时间处于静息状态，因而能够逃避放疗和化疗的杀伤而幸存。然而，和其他快速增殖的肝癌细胞相比，肝癌干细胞却表现出更强的再植成瘤能力[18, 38]。因此即使所有的快速增殖肝癌细胞均被放化疗杀伤，肝癌依然会从残存的肝癌干细胞重新生长出来[1, 39]。临床上也发现，同样的化疗后患者，高表达肿瘤干细胞标志物EpCAM、CD44、CK19及CD133的肿瘤患者预后要明显差于肿瘤干细胞标志物未高表达的患者，而抑制这些标志物表达，如抑制CD44的表达，则可以增强肿瘤化疗敏感性和加快肿瘤细胞的凋亡[7, 40-41]。

因此，根治肝癌组织最佳的治疗方法是在杀伤快速增殖的肿瘤细胞同时能够特异性地对肝癌干细胞进行靶向杀伤，最大程度的消除肿瘤组织而不损伤正常细胞[42]。根据肝癌中肝癌干细胞的生物学特性，其靶向治疗可从以下3个方面实现：①消除关键的干性标志物。基于已知的肝癌干细胞表面标志物，如CD133，CD90，OV6，EpCAM和CD44，从中筛选出影响肝癌干细胞生物学行为的关键靶分子进行靶向治疗。目前发现，EpCAM就是一个潜在的治疗靶点[43-44]。它在肿瘤干细胞中表达明显高于正常细胞，且通常提示预后较差。2009年，德国研究者率先开发了抗EpCAM和CD3的卡妥索单抗，并在Ⅱ/Ⅲ期临床研究中证实，卡妥索单抗可以明显减少卵巢癌，胃肠癌，胰腺癌等患者恶性腹水的生成，并能延长卵巢癌患者的生存期[45]，这为肝癌的靶向治疗指引了发展方向。②阻断肝癌干细胞自我更新的信号通路。例如Wnt通路抑制因子DKK1结合低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)从而阻断Wnt/β-catenin通路[46]。或利用小干扰RNA阻断Hedgehog通路——一种在胚胎发育和成年后维持肝干细胞自我更新的通路，这种方法不仅能降低肝癌细胞增殖速率同时能增强肝癌对化疗药5-氟尿嘧啶的敏感性从而诱导肝癌细胞凋亡[47]。③诱导肝癌干细胞分化。肝癌干细胞处于干细胞状态下能够抵抗放化疗，因而诱导其分化可能使其失去这种特性。肝细胞生长因子4α(HNF4α)是调节肝干细胞向肝细胞方向分化的关键因子，实验证明HNF4α高表达能够有效抑制小鼠肝癌生长，而其敲除后则促进小鼠肝癌生长[48-49]。

虽然基于肝癌干细胞的肝癌靶向治疗显示出巨大的潜力，但是目前依然停留在实验室阶段，靶向药物的开发仍存在很多限制。例如：①许多靶分子在正常肝干细胞和肝癌肝干细胞是共表达的，只是表达程度有所差异；②许多调控肝干细胞恶性转化的的信号通路同时也调控胚胎发育和器官形成，消除肝癌干细胞的同时可能会影响正常肝干细胞的生理性自我更新；③肝癌干细胞存在一定可塑性，表型表达和功能特性不稳定，对靶向药物敏感性存在一定差异。

4展望

虽然目前认为原发性肝癌的发生、转移、治疗抵抗中均发现有肝干细胞或者肝癌干细胞的参与，这对今后肝癌的生物学研究和肝癌靶向治疗指引了方向，但其中仍存在很多未解决的问题。例如，肝干细胞和肝癌干细胞的分离和鉴定均没有统一的标准，肝干细胞与肝癌干细胞之间、以及肝癌干细胞与肝癌转移干细胞是否存在谱系相关性，它们在肝癌的生物学行为中发挥作用程度的大小和作用机制依然未知。近年来，细胞谱系示踪技术结合单细胞转录组和外显子测序技术逐渐兴起，它可以动态研究肝癌各阶段(包括癌前病变期、癌症早期和中晚期)少量目的细胞的表型和分子表达变化，这可能有助于以上问题的解决，对揭示肝癌发生发展和复发转移的机理、发现肝癌早期预判和早期诊断的特异性分子标志物、寻找肝癌治疗的新靶点具有重大的理论意义和实用价值。

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[收稿2015-04-25;修回2015-05-15]

(编辑：谭秀荣)

专家论坛

Research advancement on biology of Liver Cancer based on liver stem cells

ZhiXiaosong,ZiXiaoyuan,HuYiping

(Department of Cell Biology, Second Military Medical University，Shanghai 200433,China)

[Abstract]Liver stem cells are a primitive cell population typi cally characterized by the capacity for self-renewal and bi-potential differentiation capability towards both hepatocytes and cholangiocytes. The primary liver cancer is the second fatality rate of malignant tumors in China. It is recently recognized that dysregulation of self-renewal for liver stem cell drives the liver cancer. While a set of cell populations with stem cell properties, termed liver cancer stem cells, is also found to exist in the specimens of liver cancer in advanced stages, which maintain the proliferation of liver cancer cells and is associated with the metastasis of liver cancer as well as chemotherapy and radiotherapy resistance. This review mainly introduced current research upon the role of liver stem cells and liver cancer stem cells in the initiation, metastasis and chemoradiotherapy resistance of primary liver cancer.

[Key words]liver stem cells; liver cancer stem cells; liver cancer; metastasis; chemoradiotherapy resistance

[文献标志码][中图法分类号] R730.55 A

[文章编号]1000-2715(2015)03-0209-06

[基金项目]国家自然科学基金面上项目(NO：31171309)。

[通信作者]胡以平，男，博士，教授，博士生导师，第二军医大学干细胞与医学研究中心主任。1978年7月毕业于第二军医大学军医系，1992年7月毕业于复旦大学遗传学专业，获硕士学位和博士学位。曾为美国Roswell Park肿瘤研究所博士后和美国Yale大学免疫学系副研究员。研究方向为肝干细胞的生物医学问题，研究成果发表于JBC、Stem Cells、Hepatology及Cell Stem Cell等刊物，有1篇论文入选首届“中国百篇最具影响优秀国际学术论文”。担任国家规划教材《医学细胞生物学》主编，中国细胞生物学会资深理事，中华医学会细胞生物学分会副主任委员，《中国细胞生物学报》、World Journal of Stem Cells和Journal of Single-Cell Biology等杂志编委。