双荧光素酶报告基因系统检测CYP3A4*1G增强CYP3A4表达的调控作用*

杨卫红, 闫　良, 刘利娥, 赵登职, 张　卫, 张莉蓉#

1)郑州大学基础医学院法医学系 郑州 450001　2)郑州大学基础医学院药理学系 郑州 450001　3)郑州大学公共卫生学院卫生化学与卫生检验系 450001　4)郑州颐和医院药学部 郑州 450047　5)郑州大学第一附属医院麻醉科 郑州 450052



双荧光素酶报告基因系统检测CYP3A4*1G增强CYP3A4表达的调控作用*

杨卫红1), 闫良2), 刘利娥3), 赵登职4), 张卫5), 张莉蓉2)#

1)郑州大学基础医学院法医学系 郑州 4500012)郑州大学基础医学院药理学系 郑州 4500013)郑州大学公共卫生学院卫生化学与卫生检验系 4500014)郑州颐和医院药学部 郑州 4500475)郑州大学第一附属医院麻醉科 郑州 450052

关键词CYP3A4*1G;CYP3A4启动子;双荧光素酶报告基因;转录调控

摘要目的：探讨CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达的负调控作用。方法：设计合成包含CYP3A4*1G G或A等位基因的一系列基因片段(外显子10与内含子10交界处287和181 bp)，构建CYP3A4*1G正向位于CYP3A4启动子上游的荧光素酶报告基因载体，与内参质粒pRL-TK共转染HepG2细胞，通过双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果：与CYP3A4启动子相比较， G与A等位基因在287 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=795.575，P<0.001)，且G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。与CYP3A4启动子相比较，G与A等位基因在181 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=23.218，P<0.001)，而G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：在CYP3A4内含子10与外显子10交界处CYP3A4*1G存在与CYP3A4*1G变异无关的CYP3A4启动子的抑制元件，该抑制元件对CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达起负调控作用。

AbstractAim: To study the negative regulation of CYP3A4*1G enhancing CYP3A4 gene expression．Methods: A series of reporter gene vectors carrying CYP3A4*1G G or A allele in different length DNA fragments(exon-intron junction,287 or 181 bp) located upstream of the CYP3A4 promoter in the forward direction were constructed. The above recombinant plasmids were co-transfected with internal control plasmid pRL-TK into HepG2 cells by LipofectamineTM2000, and luciferase activity was measured with dual luciferase reporter gene system.Results: Compared with CYP3A4 promoter, the G allele and the A allele in 287 bp DNA fragments both decreased the expression of luciferase(F=795.575,P<0.001),while there was no significant difference in the degree of inhibition to CYP3A4 promoter by the both alleles(P>0.05). Compared with CYP3A4 promoter, the G allele and the A allele in 181 bp DNA fragments both reduced the expression of luciferase(F=23.218, P<0.001), while there was no difference in the extent of inhibition to CYP3A4 promoter by the both alleles(P>0.05).Conclusion: There is a certain inhibition element independent on CYP3A4*1G variation of the CYP3A4 promoter，lying exon-intron 10 junction of CYP3A4,and it has negative regulation to CYP3A4*1G enhancing CYP3A4 expression.

药物代谢酶CYP3A4可代谢一半以上的常用临床药物，编码该酶的基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)是引起CYP3A4药物反应个体差异的主要因素。CYP3A4*1G是CYP3A4内含子10中的一个SNP，在中国汉族人群中等位基因频率高达20%以上[1-2]；体内研究[2-7]表明该SNP与CYP3A4代谢的多种药物的疗效密切相关，且该课题组前期研究[8]结果表明CYP3A4*1G以等位基因依赖方式调控CYP3A4内含子10增强子活性，从而增强CYP3A4的表达。CYP3A4基因不止一个增强子，如5’端增强子及被CYP3A4*1G调控的内含子10增强子，作者推测前者发挥作用时后者可能会受到抑制元件的调控，在该研究中作者采用双荧光素酶报告基因方法探讨CYP3A4*1G增强基因表达的调控作用，报道如下。

1材料与方法

1.1主要试剂与细胞限制性内切酶KpnⅠ-HF和MluⅠ(NEB公司)，T4 DNA连接酶、PCR试剂盒及引物合成(TaKaRa公司)，质粒提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；大肠杆菌DH5α(郑州大学基础医学院药理学教研室冻存)；HepG2细胞株(上海中科院细胞研究所)；pRL-TK质粒、双荧光素酶报告基因分析系统(Promega公司)。携带CYP3A4启动子的pGL3载体(即CYP3A4 pro)由课题组前期构建。

1.2载体构建与鉴定根据CYP3A4基因(AF280107)在外显子10与内含子10交界处分别设计2对引物(表1)，以人的基因组DNA(CYP3A4*1G GG/AA)为模板，利用PCR分别扩增CYP3A4*1G等位基因287和181 bp两种长度的DNA片段。PCR扩增体系(50 μL)如下：2×PrimeSTAR®Max Premix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物分别为3 μL, 模板DNA 4 μL，超纯水15 μL。PCR反应条件：98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 120 s，循环35次。目的基因片段经KpnⅠ-HF和MluⅠ双酶切、胶回收后，与双酶切的质粒CYP3A4 pro经T4 DNA连接酶于16 ℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素耐药抗性筛选，对初步筛选出CYP3A4*1G正向位于CYP3A4启动子上游的荧光素酶报告基因载体的阳性重组菌经质粒小提后用KpnⅠ-HF和MluⅠ双酶切鉴定。质粒送Invitrogen公司测序。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒备用。

表1　PCR引物、限制性内切酶及PCR扩增产物大小

下划线表示限制性内切酶酶切位点。

1.3细胞培养和转染实验HepG2细胞用含体积分数10%小牛血清及青霉素和链霉素的DMEM培养基于37 ℃、体积分数5% CO2条件下传代培养。将上述重组质粒及对照质粒与内参质粒pRL-TK按照LipofectamineTM2000说明书进行细胞转染，收集转染后48 h的细胞进行荧光素酶活性测定。实验重复4次。

1.4双荧光素酶活性测定按照Promega公司提供的双荧光素酶报告基因分析系统说明书进行操作。除去细胞培养基，PBS冲洗细胞，加入PLB细胞裂解液100 μL，室温轻缓晃动培养板15 min后再吹打细胞，收集细胞裂解液，通过生物化学发光分析仪(德国Berthold公司)进行双荧光素酶活性测定。以萤火虫荧光素酶的活性与海肾荧光素酶活性的比值表示被检测的质粒在转染细胞后所测得的荧光素酶的相对活性。实验重复4次。

1.5统计学处理采用SPSS 11.0进行数据分析。3组相对荧光素酶活性的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1重组质粒的鉴定及测序将筛选出的阳性重组质粒测序结果与目的片段序列比对，测序结果正确，测序图分别见图1及图2。

图1　含287 bp目的DNA片段的重组质粒测序图

图2　含181 bp目的DNA片段的重组质粒测序图

2.2双荧光素酶活性测定结果CYP3A4*1G等位基因在287 bp DNA片段中的双荧光素酶活性测定结果见表2。与CYP3A4启动子相比较，G与A等位基因均降低了荧光素酶的表达。

CYP3A4*1G等位基因在181 bp DNA片段中的双荧光素酶活性测定结果见表3。与CYP3A4启动子相比较，G与A等位基因均降低了荧光素酶的表达。

表2　CYP3A4*1G等位基因在

F=795.575，P<0.001；*：与CYP3A4启动子相比，P<0.05。

表3　CYP3A4*1G等位基因在

F=23.218，P<0.001；*：与CYP3A4启动子相比，P<0.05。

3讨论

双荧光素酶报告基因方法在研究基因调控(如增强子、内含子增强子及基因的负调控等)中具有独特的优势[8-12]。作者前期的双荧光素酶报告基因系统研究[8]结果表明，CYP3A4内含子10全长具有增强子功能，且此功能被CYP3A4*1G等位基因依赖性调控，由于转录后的前体CYP3A4 RNA在形成mRNA时内含子10全长被切除，推测此被切除后的内含子10全长可作为一个整体独立发挥功能。为验证CYP3A4*1G增强基因表达的负调控作用，作者通过构建CYP3A4*1G等位基因位于内含子与外显子交界处的287及181 bp DNA片段的荧光素酶载体转染HepG2细胞，发现CYP3A4内含子10与外显子10交界处存在CYP3A4启动子的抑制元件，但该抑制元件对CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达起负调控作用。已有研究[13]发现，hPLP1的剪接变异体中包含了来自其内含子1的外显子，且与增强其基因表达有关，表明内含子与外显子并存时可影响基因表达，从理论上支持了该实验外显子与内含子交界处序列可影响基因表达的结果。

该研究中构建CYP3A4*1G荧光素酶载体时虽然所用的一种目的DNA的长度(287 bp)及序列与文献[14]均一致，但该研究结果与其发现CYP3A4*1G A等位基因比G等位基因具有较强的转录活性不一致，主要原因是所用启动子不同。文献[14]所用启动子为CMV启动子，该研究所用启动子为目的基因的启动子CYP3A4启动子。研究目的片段时所用启动子不同，可能会出现不同的结果。例如，Pound等[15]研究目的片段功能时先用了具有CMV启动子的载体，后来又用其目的基因启动子进一步验证时出现了类似情况。另外，为验证该实验结果的可靠性，作者又采用181 bp DNA片段进行验证，发现CYP3A4*1G在这两种不同长度DNA片段中的实验结果一致，进一步支持了CYP3A4*1G在287 bp DNA片段中的结果。

综上所述，该研究结果表明在CYP3A4内含子10与外显子10交界处(CYP3A4*1G附近)存在CYP3A4启动子的抑制元件，且该抑制元件对CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达起负调控作用。该发现为阐明CYP3A4*1G影响CYP3A4药物代谢的体内机制提供了理论基础，也为研究内含子SNP调控基因表达提供了新的思路。

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*河南省科技厅重点科技攻关项目142102310434

Regulation role of CYP3A4*1G enhancing CYP3A4 expression detected by dual luciferase reporter gene system

YANGWeihong1),YANLiang2),LIULi′e3),ZHAODengzhi4),ZHANGWei5),ZHANGLirong2)

1)DepartmentofForensicMedicine,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofPharmacy,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500013)DepartmentofSanitaryChemistryandHealthInspection,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)DepartmentofPharmacy,YiheHospitalofZhengzhou,Zhengzhou4500475)DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsCYP3A4*1G;CYP3A4 promoter;dual luciferase reporter gene;transcriptional regulation

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.010

中图分类号R394-33/Q756

通信作者#，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向：药物基因组学，E-mail:zhanglirongzzu@126.com