不同粒径羟基磷灰石对人工早期龋再矿化作用的研究*

刘成霞，申晓青，徐平平#

1)南方医科大学附属口腔医院(广东省口腔医院) 广州 510280　2)南方医科大学珠江医院口腔科 广州 510280



不同粒径羟基磷灰石对人工早期龋再矿化作用的研究*

刘成霞1)，申晓青2)，徐平平1)#

1)南方医科大学附属口腔医院(广东省口腔医院) 广州 5102802)南方医科大学珠江医院口腔科 广州 510280

关键词早期釉质龋；羟基磷灰石；再矿化

摘要目的：研究不同粒径羟基磷灰石(HA)对人工早期龋的再矿化作用。方法：应用离体人恒前磨牙制备早期釉质龋标本50个，随机分为5组(n=10)：阳性对照组(NaF溶液)、阴性对照组(去离子水)、30 nm HA组、60 nm HA组和12 μm HA组，用显微硬度计检测标本脱矿前后表面显微硬度，并用扫描电镜观察各组样本脱矿前后的形态；按照分组进行早期龋体外循环实验12 d，同法测定体外循环后各组样本的表面显微硬度，并观察其形态。结果：与阴性对照组相比，各HA组均能提高标本的表面显微硬度，且随着粒径的减小，其表面显微硬度增大(F=86.272,P<0.001)。扫描电镜下观察，30 nm HA组和60 nm HA组的脱矿区有针状或短棒状晶体颗粒沉积，表面变得均匀、平整，且以30 nm HA组的再矿化效果更佳，12 μm HA组的再矿化效果不明显。结论：HA能有效促进早期釉质龋的再矿化；纳米级HA优于微米级HA，且随着粒径的减小，其再矿化效果更佳。

AbstractAim: To explore the effect of various particle size hydroxyapatite(HA) on remineralization of artificial initial enamel caries.Methods: Fifty human premolars were prepared for artificial enamel caries specimens, and these specimens were randomly allocated into 5 groups(n=10): positive control group(NaF solution), negative control group(deionized water), 30 nm HA group, 60 nm HA group and 12 μm HA group.Before and after demineralization, the surface microhardness of the specimens was measured by microhardness tester and the morphologies of the specimens were observed by scanning electron microscope. Then after the experiment of 12 d cycling in vitro, the surface microhardness of each group′s specimens was measured and the morphologies were observed again.Results: Compared with negative control group, all the 3 HA groups could significantly improve the surface microhardness of initial enamel caries,and the effects were better with the decrease of particle size(F=86.272,P<0.001). Under the scanning electron microscope, crystalline particles with acicular or short bar deposited and the surface became uniformly smooth in the demineralization area of 30 nm HA group and 60 nm HA group especially for the 30 nm HA group, and the effect of 12 μm HA group on remineralization were unobvious.Conclusion: HA can effectively promote the remineralization of initial enamel caries. Nano HA is superior to micron HA, and with the decrease of particle size, the effect of remineralization can be better.

龋病是口腔最常见的疾病，其患病率随年龄增长呈上升的趋势，严重影响人类的口腔乃至全身健康。食物来源的碳水化合物产酸，使牙体硬组织脱矿，导致龋损发生。龋病的发生是脱矿与再矿化不断交替变化的过程。因此，可以通过再矿化的方法促进龋损的自然修复使其愈合。羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)在牙釉质中的含量高达96%，具有良好的生物相容性和生物活性，已成为近年来生物材料研究的热点之一[1-4]。研究[5]表明HA具有再矿化作用。随着纳米材料研究的深入，对HA 的研究也进入了探索纳米HA(nano HA, n-HA)的新阶段。随着n-HA粒径的不断减小，比表面不断增大，生物活性增高，是否粒径越小其再矿化效果越佳？作者拟通过早期龋体外循环模型[6]研究不同粒径HA对早期釉质龋的再矿化作用。

1材料与方法

1.1釉质块标本的制备收集南方医科大学附属口腔医院口腔颌面外科门诊因正畸治疗新鲜拔除的16~26岁健康人的恒前磨牙，清理干净后 4 ℃下保存于饱和麝香草酚溶液中。所有牙齿在肉眼及显微镜下观察无龋坏、无白垩斑、无裂纹或其他缺损。使用金刚砂车针在冷水冷却下将牙冠切割制成釉质块。用显微硬度计(Knoop压头,10 g,15 s) 在每个釉质块表面中央垂直测量5个点，并计算其平均值，即基线表面显微硬度(surface microhardness,SMH)选择表面显微硬度值为305~355 KHN的釉质块，并在其表面中心开窗(4 mm×4 mm)，其余部位先涂布2层抗酸指甲油后以自凝树脂包埋[7-9]。该研究经南方医科大学附属口腔医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2早期釉质龋模型的建立将上述釉质块标本放入体积分数10%的柠檬酸溶液中酸蚀120 s，去除柠檬酸溶液，建立早期釉质龋模型。同法测量并计算脱矿后的表面显微硬度(SMH1)，选择50个硬度值在155~185 KHN的釉质块进行以下观察。

1.3实验分组和处理HA由北京高德威金属科技开发有限责任公司提供。HA实验组溶液的配制方法：准确称取粒径分别30 nm、60 nm、12 μm的HA各0.30 g分别置于烧杯中，取100 mL双蒸水加入烧杯中，超声振荡3次，每次30 s，以形成均匀的悬浊液，然后放置磁力搅拌器搅拌均匀。脱矿溶液(pH=4.5)含50 mmol/L醋酸、2.2 mmol/L Ca(NO3)2、2.2 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L NaN3；人工唾液(pH=7.0)含130 mmol/L KCl、20 mmol/L HEPES、1.5 mmol/L CaCl2、1 mmol/L NaN3、0.9 mmol/L KH2PO4[10]。将上述50个标本随机分为5组(10个/组)。阳性对照组给予1 g/L NaF溶液，阴性对照组给予去离子水，30 nm HA组、60 nm HA组和12 μm HA组分别给予相应的HA实验组溶液。

再矿化实验：采用体外循环流程，在37 ℃恒温水浴箱中持续处理12 d。每天的体外循环包括：在相应溶液中浸泡处理4次(上午8时和9时，下午3时和4时)，每次3 min，之后用去离子水冲洗5 s；上午11时至下午1时在脱矿液中浸泡2 h，其余时间浸泡在人工唾液中。所用试剂均为每天新鲜配制。

1.4扫描电镜观察及显微硬度检测采用Quanta 400 FEG场发射扫描电镜(荷兰飞利浦FEI公司)，在制备釉质块后(脱矿前)和脱矿后进行扫描电镜观察；在体外循环后从各组中随机抽取5个标本，用于再矿化后的扫描电镜观察：将标本按观察窗口面向上的方向固定在载物台上，粘台，表面喷金，真空下干燥，在扫描电镜下观察(每个标本随机观察3个不同区域)，拍摄电镜图像并存储。

各组另外5个标本用于显微硬度测量，同法使用显微硬度仪在各釉质块窗口基线测量点的另一侧平行测量5个点，计算其平均硬度值，即再矿化后的表面显微硬度(SMH2)。计算每组表面显微硬度恢复的百分比(%SMHR)。%SMHR=(SMH2-SMH1)/(SMH-SMH1)×100%。

1.5统计学处理采用SPSS 16.0处理数据。应用配对t检验来比较体外循环前后各组的表面显微硬度值(SMH1和SMH2)，应用单因素方差分析比较各组%SMHR，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1釉质块表面显微硬度的检测结果见表1。

表1　各组牙釉质表面显微硬度分析　KNH

*：F=86.272，P<0.001；△：5组间两两比较，P均<0.05。

2.2扫描电镜下正常釉质和脱矿釉质的表面形貌

低倍镜下可见正常釉质表面光滑平坦(图1A)，高倍镜下可见排列整齐的釉柱面 (图1B)。脱矿后正常光滑的釉质表面变得粗糙，布满孔状结构，原来排列紧密的釉柱变得疏松(图1C)。

图1　正常釉质和脱矿釉质的扫描电镜图像

A、B:分别是正常釉质在10 000和100 000倍镜下；C：脱矿釉质在60 000倍镜下。

图2　各组再矿化后的扫描电镜图像

2.3扫描电镜下的再矿化效果见图2。由图2可见，阳性对照组矿化后的表面变得较为平整，有许多圆形间或长条状的颗粒沉积。30 nm HA组和60 nm HA组矿化后的釉质表面变得规则、均匀；在脱矿面上可见均匀密集的针状或短棒状的晶体颗粒沉积，与正常釉质结构镶嵌紧密；30 nm HA 组不见脱矿孔孔隙，60 nm HA组可见极少数脱矿孔孔隙。12 μm HA组釉质表面可见大颗粒悬浮于表面；高倍镜下其外观与阴性对照组相似，且因晶体粒度大，不能进入脱矿釉质深层，可见部分脱矿孔孔隙。A、B、C、D、E：分别为阳性对照组、30 nm HA组、60 nm HA组、12 μm HA组和阴性对照组；1、2：分别为10 000倍镜下和60 000倍镜下。

3讨论

随着人们生活水平的提高，饮食结构也变得越来越多样化，由此带来的牙齿健康问题也愈加突出。据第三次全国口腔健康流行病学调查[11]报告，我国35~44岁人群患龋率为88.1%，65~74岁人群患龋率高达98.4%。因此，预防龋病对提高广大人民群众的口腔卫生水平非常重要。

长期以来，人们认为龋病是一个以脱矿为主的病变，其发生发展的过程不可逆，牙齿内的矿物质永久性丢失，最终形成了龋洞。而现代龋病学理论认为：龋病的发生是一个脱矿与再矿化不断交替变化的过程。再矿化是溶液中的钙磷等离子重新沉积到部分溶解的晶体表面并诱导其重新增长的过程，它不但可以维持牙釉质内矿物质丢失与获得之间的动态平衡，而且还能促进龋损的自然修复[12]。

目前纳米材料的研制是一个热门方向。纳米材料是指颗粒尺寸为1~100 nm的粒子组成的新型材料[5]。n-HA是颗粒尺寸在1~100 nm的HA，相比普通的HA，n-HA由于粒径小，比表面积大及具有量子尺寸效应，故在抗龋、美白和脱敏等各方面均表现出优于普通HA的效应，因此也被称为活性HA。并且随着n-HA粒径的不断减小，比表面的不断增大，表面原子数增多、表面原子配位不饱和性升高，从而产生了大量的悬键和不饱和键等，使其具有更高的表面能、高静电场等特性，以及更高的化学活性和良好的生物活性[13]。

牙釉质的基本结构是釉柱。釉柱是由粒径为40~60 nm针状或柱状的HA晶体构成，属于n-HA。n-HA与牙釉质中HA的化学成分和微晶结构极为相似，所以n-HA可以直接和牙体硬组织中的HA发生融合，修复牙齿表面裂痕[14-15]。HA再矿化的可能作用机制：首先，由于HA具有微弱的溶解性和碱性，为牙釉质脱矿区提供了钙、磷及羟基，可以有效补充无机盐的丢失，增加了钙离子的迁移机会，推动平衡向再矿化方向发展，利于龋损的修复；其次，脱矿区表面有活性基团，HA通过与其发生化学结合反应来修复龋损；再次，该研究采用的HA晶粒直径较小，尤其是30 nm HA，接近甚至小于釉质表层磷灰石晶粒直径，且在龋病的发生过程中，釉质因脱矿而导致间隙扩大，产生微孔，这使得n-HA有可能进入表层下脱矿区，通过机械沉积作用封闭脱矿层而预防龋病和修复早期龋。

该研究结果显示，各HA组离体牙釉质脱矿后显微硬度值明显减小，经过早期龋体外循环后，显微硬度值得到明显提升，说明HA有明显的再矿化作用，且n-HA明显优于微米级HA。该结果验证了前期关于含60 nm HA牙膏组促进釉质龋再矿化优于12 μm HA牙膏组的研究结论[16]。该研究结果还显示，随着粒径的减小，HA组再矿化能力也不断增强，%SMHR最高的是30 nm HA组，达64.3%。

此外，扫描电镜观察结果也进一步证实HA有促进早期龋的再矿化的作用，其结果与表面显微硬度测量结果一致。30 nm HA组和60 nm HA组标本脱矿面上可见针状或短棒状的晶体颗粒沉积封闭，与正常釉质结构镶嵌紧密，以30 nm HA 组的再矿化效果最好；12 μm HA组再矿化作用不明显。

综上所述，HA可提高脱矿釉质的表面显微硬度，促进牙齿再矿化，且随着粒径的减小，其再矿化效果也越来越好。n-HA在早期龋的防治领域具有较大的临床应用前景。

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Effect of various particle size hydroxyapatite on remineralization of artificial initial enamel caries

LIUChengxia1),SHENXiaoqing2),XUPingping1)

1)TheAffiliatedStomatologicalHospitalofSouthernMedicalUniversity(GuangdongProvincialStomatologicalHospital),Guangzhou5102802)DepartmentofStomatology,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510280

Key wordsinitial enamel caries;hydroxyapatite;remineralization

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.031

中图分类号R781.1

通信作者#，男，1971年7月生，博士，教授，研究方向：口腔生物材料，E-mail:gdskqyykjk@163.com