土壤微生物对黄花蒿凋落物或青蒿素的响应

李倩，袁玲，杨水平，黄建国

(西南大学资源环境学院，重庆 400716)

土壤微生物对黄花蒿凋落物或青蒿素的响应

李倩，袁玲，杨水平，黄建国*

(西南大学资源环境学院，重庆 400716)

摘要：黄花蒿主要通过植株残体向土壤释放化感物质，影响土壤肥力和生产力。本试验开展了土壤微生物对黄花蒿凋落物和青蒿素的响应研究。结果表明，在土壤中添加黄花蒿凋落物和青蒿素，真菌数量增加，但显著降低放线菌、自生固氮菌、硝化细菌和亚硝化细菌的数量，不利于土壤有机质矿化，生物固氮和硝化作用。黄花蒿凋落物和青蒿素降低微生物熵，增大代谢熵，说明土壤微生物代谢受到干扰，活性降低。此外，黄花蒿凋落物和青蒿素还使土壤微生物标记性磷脂脂肪酸总量和种类以及细菌、放线菌和原生动物标记性磷脂脂肪酸减少，选择性地抑制了土壤微生物的繁殖生长。在黄花蒿凋落物、青蒿素和对照(不加凋落物和青蒿素)的土壤中，微生物种群结构差异显著，黄花蒿凋落物和青蒿素降低微生物多样性和均匀度指数。因此，在大规模集约化种植黄花蒿的过程中，进入土壤的凋落物抑制有益微生物生长繁殖，改变土壤微生物群落结构，种群减少，密度降低，这可能是黄花蒿抑制后茬和周围植物生长，进而造成减产的重要原因之一。

关键词：凋落物；黄花蒿；青蒿素；土壤微生物；磷脂脂肪酸

Responses of soil microorganisms toArtemisiaannualeaf litter or artemisinin

LI Qian, YUAN Ling, YANG Shui-Ping, HUANG Jian-Guo*

CollegeofResourcesandEnvironment,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China

Abstract:Artemisia annua releases many kinds of allelochemicals into soils via dead plant residues, either by rain leaching or root exudation. Dead leaves of A. annua contribute more than 80% of the total artemisinin that enters soils during the growth period of A. annua. Allelochemicals released by the dead leaves reduce the growth and yields of succeeding and adjacent crops. Soil microbes play roles in nutrient transformation, organic matter recycling, toxicant decomposition, and hormone efflux, and thus, are important for plant growth and development. However, little is known about the effects of these allelochemicals on soil microorganisms. In these experiments, artemisinin and A. annua leaf litter were each added to soil and changes in microbial biomass and community structure were evaluated. The growth and reproduction of culturable microorganisms in soils showed wide variations in response to A. annua leaf litter or artemisinin. For example, the number of fungi increased but the numbers of actinomycetes, azotobacteria, nitrobacteria, and nitrite bacteria significantly decreased in soils containing A. annua leaf litter or artemisinin. The results suggested that both leaf litter or artemisinin inhibited organic matter mineralization, nitrogen bio-fixation, mobilization of phosphorus and potassium, and nitrification. The soil microbial quotient decreased, while the metabolic quotient increased, after A. annua and artemisinin were added to soils. This result indicated that artemisinin and other allelochemicals in the leaf litter interfered with the metabolism of soil microorganisms. The types and total contents of signature phospholipid fatty acids of microbes such as actinomycetes and protozoa decreased in soils containing leaf litter or artemisinin. The diversity and evenness indices of the microbial community also decreased, suggesting that the soil microbial ecosystem deteriorated as the densities of various microbial groups decreased. Therefore, artemisinin and allelopathic chemicals released from A. annua leaf litter affect the microbial community structure in soils, and may pose a risk to soil ecosystems in the areas where A. annua is widely cultivated. Further research is required to clarify the mechanisms by which allelopathic chemicals from A. annua change the structure of microbial communities in soil.

Key words:litter; Artemisia annua; artemisinin; soil microorganism; PLFAs

黄花蒿(Artemisiaannua)属菊科草本植物，俗名青蒿，在我国已有两千多年的药用历史，是提取抗疟疾的首选药物——青蒿素的唯一原料药材[1]。在黄花蒿生长过程中，主要通过植株残体(贡献率>80%)向土壤生态系统释放多种化感物质，如倍半萜类、黄酮类、香豆素类和挥发油类等[2-5]。其中，青蒿素和甲氧基黄酮最为丰富，直接或者间接抑制植物生长发育[3]。因此，大规模栽培黄花蒿严重影响周围及后茬作物的生长发育，造成大幅度减产甚至绝收[6]。

Dhingra等[7]发现，青蒿素及其合成前体——青蒿酸能够抑制发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的生长。青蒿油能有效杀灭金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeraginosa)和芽孢杆菌(Bacillus)[8]。将青蒿素加入种植和未种植黄花蒿的土壤中，后者的细菌数量比前者降低51%，说明青蒿素选择性地抑制了土壤细菌的生长繁殖[9]。医学研究表明，青蒿素干扰细菌生理代谢，其临界浓度极低，2.4 mg/kg就会产生明显作用[10]。进入土壤中的青蒿素分解缓慢，35~60 d后仍然高于检测极限[11]，对土壤微生物产生持续作用。总之，黄花蒿释放的化感物质影响土壤微生物的群落结构，但有关研究尚待深入。

土壤是植物生长的场所，亦是土壤微生物天然的培养基，微生物释放多种土壤酶，驱动有机质降解、腐殖质合成、养分循环、污染物降解等生物化学过程与有机质矿化，是土壤肥力和生产力的基本要素之一。在此基础上，本文研究黄花蒿凋落物和青蒿素对土壤微生物群落结构的影响，为降低黄花蒿的化感效应和保持土地生产力提供理论依据。

1材料与方法

1.1　供试材料

供试土壤为重庆市典型、具有代表性的灰棕紫泥，中壤质地、pH 6.13、有机质14.72 g/kg、全氮1.12 g/kg、全磷0.54 g/kg、全钾16.22 g/kg、碱解氮28.27 mg/kg、有效磷19.07 mg/kg、速效钾92.57 mg/kg。采集0~20 cm耕作层，拣去杂物，过3 mm 筛，加水至最大田间持水量的(70±2)%。土壤加入葡萄糖6 mg/kg，培养24 h，活化微生物，再加入400 mg 尿素混匀，取500 g土壤置于750 mL聚乙烯盒中。

田间采集黄花蒿新鲜凋落物(主要为叶片和叶柄，内含10.5 mg青蒿素/g)，凉干，粉碎过1 mm筛。青蒿素购自重庆市中药研究院(纯度≥95%)。

1.2　试验设计

2013年，在黄花蒿生育期，进入土壤的凋落物总量可达2.4 g/kg (0~10 cm)~4.8 g/kg (0~5 cm)[12-14]， 约等于24~48 mg 青蒿素/kg干土。因此，在每kg供试土壤中，分别加入2.4和4.8 g黄花蒿凋落物，以及24和48 mg 青蒿素，混合均匀，不加凋落物和青蒿素的为对照，依次用A1、A2、A3、A4和CK表示。(28±1)℃恒温培养20 d(在土壤中，青蒿素的半衰期为0.9~13 d)[11]。备测有关项目，试验设置6次重复。

1.3　测定项目与方法

培养结束后，利用稀释平板分离计数法测定土壤中的细菌(牛肉膏蛋白胨培养基)、真菌(马丁氏培养基)、放线菌(高氏一号培养基)，自生固氮菌(Ashby无氮培养基)；MPN法测定土壤氨化细菌(蛋白胨琼脂培养基)、亚硝化细菌(改良Stephenson培养基A)和硝化细菌数量(Stephenson改良培养基B)[15]；土壤微生物生物量采用氯仿熏蒸-0.5 mol/L K2SO4提取，提取液中的微生物生物量碳用K2Cr2O7氧化法测定；土壤基础呼吸采用室内密闭培养-1 mol/L NaOH碱液吸收法测定; 微生物熵为微生物生物量碳与总有机碳的比值， 土壤微生物代谢熵(qCO2)即土壤微生物基础呼吸与土壤微生物生物量碳之间的比值[16]。

微生物磷脂脂肪酸(phosphorlipid fatty acids，简称PLFAs)的命名、提取和分析参照文献[17-19]。操作步骤为：每个处理取3个重复，各重复取10 g 的新鲜土样于50 mL的离心试管中，加入20 mL的0.2 mol/L的KOH甲醇溶液，混匀后 37℃温育1 h，每10 min涡旋1次，确保磷脂脂肪酸释放并甲脂化。加入3 mL 1 mol/L的醋酸溶液中和pH值后摇匀。加10 mL正己烷，800 r/min离心15 min后，经N2将上层正己烷干燥后，溶解于1 mL体积分数为1∶1的正己烷甲基丁基醚溶液中，利用气相色谱(Hewlett-Packard 6890)测定其含量。色谱条件为：HP-5MS(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)石英毛细管色谱柱；升温程序为 70℃ 保持 5 min，20℃/min升至190℃，保持1 min，5℃/min升到200℃，停留2 min，10℃/min升到280℃，保留8 min；进样口温度：250℃；载气：He(0.9 mL/min)；分流比：10∶1；离子源温度：230℃；四极杆：150℃；质谱全扫描范围：30～600 m/z。以甲酯化的 C19:0(non-adecanoate)为内标，Bacterial Acid Methyl Esters Mix (47080-U, Sigma-Aldrich)为外标，微生物标记性磷脂脂肪酸的分类见表1。

表1　微生物标记性PLFAs分类

注：i、a、cy和Me分别表示异丙基、反异丙基、环丙基和甲基分支脂肪酸；ω后跟的数字表示出现双键的碳原子位序；c和t分别表示该双键为顺式构型和反式构型。

Note: i, a, cy and Me areiso-, anteiso-,cyclopropylandmethylbranchingfattyacids,respectively.ω,candtrefertothealiphaticend, cis-andtrans-configurationsoffattyacids.

1.4　数据处理

用土壤PLFAs含量计算土壤微生物的种群特征值，包括多样性指数、均匀度指数和优势度指数等。

Pielou均匀度指数J′ 的计算公式为：J′=H′/lnS；

其中，Pi=Ni/N，Ni为iPLFAs含量，N为微生物的PLFAs总量，S为PLFAs总含量[20]。

用Excel 2007对试验数据进行基本计算，SPSS 19.0进行统计分析。单因素方差分析(one way-ANOVA)检验不同处理间差异显著性，CANOCO 4.5主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)不同处理间土壤微生物群落结构差异，显著水平设置为P<0.05。

2结果与分析

2.1　土壤微生物数量

由表2可知，加入黄花蒿凋落物后，土壤中的可培养细菌、真菌和氨化细菌数量增加，但放线菌、自生固氮菌、硝化细菌和亚硝化细菌数量减少；加入青蒿素后，土壤中的真菌数量显著增加，氨化细菌无显著变化，其余可培养微生物的数量均显著下降，当青蒿素的浓度为4.8 mg/kg时，细菌、放线菌、自生固氮菌、硝化细菌和亚硝化细菌的数量分别下降61.9%，66.2%，77.3%，16.0%和52.6%。

表2　不同处理对土壤微生物数量的影响

注：在同一列中，平均值±标准差后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note: In each column, the average ± standard error (n=12) followed by different small letters are significantly different atP<0.05. The same below.

2.2　土壤微生物活性

由表3可知，加入黄花蒿凋落物之后，土壤呼吸强度相对于CK提高(A2)或无显著变化(A1)，微生物生物量碳和微生物熵显著降低，微生物代谢熵增加。加入青蒿素之后，土壤微生物生物量碳、土壤呼吸强度和微生物熵相对于CK降低，微生物代谢熵提高。

表3　土壤微生物活性

表4　青蒿素和黄花蒿凋落物处理土壤中微生物PLFAs含量

注：在同一行中，有不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note: Data followed by different small letters in the same row are significantly different atP<0.05.The same below.

2.3　微生物磷脂脂肪酸(PLFAs)

由表4可知，在CK、A2和A4处理土壤中，分别检测出33、29和26种标记性PLFAs，包括代表细菌的12:00、a14:0、14:00、i14:0、15:02OH、15:03OH、a15:0、i15:0、i15:1、16:00、10Me16:0、a16:0、i16:0、16:12OH、16:01、16: 1ω9c、17:00、a17:0、cy17:0、i17:0、i17:03OH、18:00、i18:0、11Me18:1w7c、Cy19:0w8c、i19:0、20:00和20:1w9c，代表放线菌的10Me 17:0和10Me18:0，代表真菌的18:1w9c 和18:3w6c (6,9,12)，以及代表原生动物的20:4w6,9,12,15c。

从PLFAs总量看，CK最高，达到920.00 μg/g，A2次之，为668.37 μg/g，A4最低，仅485.00 μg/g。加入黄花蒿凋落物和青蒿素之后，代表G+细菌的PLFAs降低了38.6%~56.3%，代表G-细菌的PLFAs降低了18.1%~44.5%，代表细菌(G-+G+)的PLFAs总量降低了30.5%~54.6%，代表原生动物的PLFAs降低了49.3%~74.7%，代表放线菌的PLFAs降低了34.6%~53.0%，代表真菌的PLFAs提高了47.0%~109.7%。

在加入黄花蒿凋落物的土壤中，14:00、i14:0、15:0 3OH、i15:0、16:00、a16:0、i16:0、16:12OH、16: 1ω9c、17:00、a17:0、cy17:0、i17:03OH、i18:0、10Me18:0、11Me18:1w7c、20:00、20:1w9c和20:4w6,9,12,15c等PLFAs含量显著下降，未检测到a14:0、15:0 2OH、18:3w6c (69,12)和i19:0 4；12:00、 a15:0、i15:1、10Me16:0、16:01和18:00无显著变化。在加入青蒿素的土壤中，未检测到12:00、i14:0、15:0 2OH、i15:1、16: 1ω9c、18:3w6c (6,9,12)和i19:0 7；a15:0,i17:0和cy19:0w8c 无显著变化；其余PLFAs显著降低。但是，加入黄花蒿凋落物和青蒿素之后，代表真菌的18:1w9c含量显著增加，G+/G-降低，真菌/细菌增加。

2.4　微生物群落特征

表5是利用PLFAs计算获得的土壤微生物种群特征值。其中，多样性指数和均匀度指数CK显著高于A2和A4处理；相反，在A2和A4处理的土壤中，微生物的优势度指数变化于0.920~0.938之间，A2显著高于CK (0.903)。

2.5　土壤微生物群落PLFAs结构分析

图1是不同处理的土壤中，微生物标记性PLFAs(相对含量大于2%)的主成分结构变异。

表5　利用PLFAs获得的土壤微生物种群特征值

图1　土壤微生物群落磷脂脂肪酸组成的主成分分析Fig.1　Principal component analysis of PLFAs in soil microorganism communities

其中，主成分PC1和PC2分别表示不同群落间92.6%和5.2%的变异度。代表CK、A2和A4不同处理的点在主成分坐标体系中分布距离较远，CK位于右下方(象限IV)，A4位于左下方(象限III)，A2基本位于正上方。

3讨论

青蒿素属于倍半萜类化合物，主要在叶片中合成[21-22]。在黄花蒿生长过程中，叶片的凋落量可达叶片总量的34%，凋落叶片中含有大量的青蒿素及其合成前体——青蒿酸[7,12,23]。将黄花蒿凋落物加进土壤之后，在微生物的作用下分解释放出青蒿素和青蒿酸。本项研究表明，在土壤中添加黄花蒿凋落物和青蒿素，可以选择性地抑制或促进土壤微生物的生长繁殖。研究证明，黄花蒿提取物也选择性地抑杀人畜病原微生物，如大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪链球菌(Enterococcusfaecalis)、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)和黑曲霉(Aspergillusniger)等[7,23-27]。此外，黄花蒿凋落物和青蒿素也显著抑制土壤放线菌、自生固氮菌、硝化细菌和亚硝化细菌的生长繁殖。放线菌参与土壤有机质循环，形成土壤结构，分泌抗生素[28]；自生固氮菌不仅能生物固氮，而且还能分泌生长激素，活化土壤磷钾[29-30]；硝化细菌和亚硝化细菌参与土壤硝化作用，直接影响植物对氮的吸收利用[31]。因此，土壤有益微生物减少不利于植物生长发育，危害土壤健康功能。

微生物代谢熵(qCO2)是土壤基础呼吸强度与微生物生物量碳的比值，反映土壤微生物的碳源利用效率。代谢熵愈大，微生物呼吸消耗的碳源越多，用于构造生物体的碳源越少，碳源的利用效率也越低[32]。抗生素和恶劣环境均能干扰微生物代谢活动，提高或降低呼吸强度，增大代谢熵，降低生长繁殖速率[33-34]。此外，青蒿素类衍生物可以通过抑制线粒体和质膜上的电子传递呼吸链，致使线粒体膜去极化，活性氧及细胞色素C含量增加，最终诱导细胞凋亡[35]。将大量的黄花蒿凋落物(A2)加入土壤之后，提高土壤呼吸强度，高浓度的青蒿素(A4)可以降低土壤呼吸强度，但微生物代谢熵均显著增加，表明青蒿素干扰了土壤微生物体内的物质和能量代谢，碳源利用效率降低，细胞构建受到抑制，导致生长繁殖速率下降。这可能是加入黄花蒿凋落物和青蒿素之后，土壤放线菌、自生固氮菌、硝化细菌和亚硝化细菌数量减少，微生物标记性PLFA总量降低的重要原因之一。

在对照、添加黄花蒿凋落物和青蒿素的土壤中，微生物标记性PLFAs分别为33、29和26种，说明黄花蒿凋落物和青蒿素使土壤微生物种群减少。其中，黄花蒿凋落物和青蒿素对标记性PLFAs的影响因微生物种类不同而异；代表细菌总量，G+/G-细菌、放线菌和原生动物等的标记性PLFAs不同程度地降低，真菌/细菌增加，说明黄花蒿凋落物和青蒿素选择性地抑制了土壤微生物的生长繁殖，影响微生物的群落结构，与前人的研究结果一致[9]。青蒿素能有效杀灭引起人类疟疾的原生动物——疟原虫，成为治疗疟疾的首选药物[36]，黄花蒿凋落物和青蒿素也使土壤原生动物标记性PLFAs降低。在土壤中，蚯蚓和线虫等是最重要的原生动物。蚯蚓参与土壤有机质转化，结构形成，还能分泌生长活性物质，与土壤肥力和生产力密切相关，蚯蚓数量减少意味着土壤肥力和生产力降低。但是，线虫通常引起植物根系病害，黄花蒿凋落物和青蒿素抑杀土壤线虫，可以作为生物农药用于防治作物根系病害。因此，取利避害是黄花蒿集约化栽培中尚需研究的课题之一。

土壤微生物群落PLFAs组成的主成分分析结果显示，代表对照、添加黄花蒿凋落物和青蒿素处理的点在主成分坐标体系中分布于不同位置，且距离较远，说明这3种土壤微生物群落结构差异显著。从它们的群落特征值来看，黄花蒿凋落物和青蒿素降低微生物群落的多样性指数和均匀度指数。多样性指数表示生物群落中的物种数量，数值愈大表示生物群落中的物种越丰富；均匀度指数越大，生物群落中的种群密度越高[37-38]。一般而言，在稳定良好的生态环境中，有益于微生物的生长繁殖、种群增加、密度增大、多样性指数和均匀度指数较高，反之亦然[39-40]。在加入黄花蒿凋落物和青蒿素的土壤中，微生物多样性指数和均匀度指数降低，说明土壤环境恶化，微生物种群减少，密度降低。

总之，黄花蒿凋落物和青蒿素对土壤微生物的影响因种类不同而异，它们的标记性PFLAs含量下降，种类减少，群落结构改变，多样性指数和均匀度指数降低。

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通讯作者*Corresponding author. E-mail: huang99@swu.edu.cn

作者简介：李倩(1987-)，女，河南郑州人，在读博士。E-mail:qianqingzi@qq.com

基金项目：国家973计划项目(2013CB127405)和中央高校基金(SWU113094)资助。

收稿日期：2014-10-13；改回日期：2014-11-17

DOI：10.11686/cyxb2014425http://cyxb.lzu.edu.cn