针刺耳穴对血管性痴呆大鼠学习记忆及海马胆碱乙酰转移酶表达的影响

杨　琼　戴桃李　潘　娅　陈　粲

(贵州民族大学化学与环境科学学院药学教研室，贵州　贵阳　550025)



针刺耳穴对血管性痴呆大鼠学习记忆及海马胆碱乙酰转移酶表达的影响

杨琼戴桃李1潘娅2陈粲2

(贵州民族大学化学与环境科学学院药学教研室，贵州贵阳550025)

摘要〔〕目的探讨针刺耳穴治疗血管性痴呆(VD)大鼠的机制。方法四血管阻断法建立VD大鼠模型，造模后针刺“肾”、“心”耳穴治疗，用Morris水迷宫检测大鼠空间记忆能力，免疫组织化学法检测其海马胆碱乙酰转移酶(ChAT)免疫反应阳性细胞表达。结果针刺耳穴后，VD大鼠学习记忆能力明显提高(P<0.01，P<0.05)，海马ChAT免疫反应阳性神经元明显增多(P<0.05)。结论针刺“肾”、“心”耳穴可改善VD大鼠学习记忆功能，可能与其促进ChAT在脑的表达、保护胆碱能神经元有关。

关键词〔〕血管性痴呆(VD)；针刺；耳穴；学习记忆；胆碱乙酰转移酶

1暨南大学医药生物技术研究开发中心

2贵州医科大学基础医学院生理学教研室

第一作者：杨琼(1980-)，女，硕士，讲师，主要从事神经生理学研究。

血管性痴呆(VD)是由于缺血或出血性脑血管病及全脑缺血、缺氧引起的认知障碍，以学习记忆功能缺损为主，可伴有语言、运动、视空间技能及人格障碍等表现〔1〕。在我国，VD是老年期痴呆中最常见的类型之一，也是目前可预防和有希望治疗的一种痴呆，但目前尚缺乏特效的VD治疗方法〔2〕。中医疗法具有操作简单、无毒副作用、标本兼治的优势〔3,4〕。本研究在制备VD大鼠模型的基础上，采用针刺“心”、“肾”耳穴的方法进行治疗，然后检测VD大鼠学习记忆能力，并测定海马齿状回处胆碱乙酰转移酶(ChAT)的水平，以探讨此方法的有效性及其可能机制。

1材料与方法

1.1 动物及试剂5～6月龄健康雄性SD大鼠45只，体重280～300 g，清洁级，由贵阳医学院动物中心提供。ChAT检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备和治疗方法大鼠随机分为对照组、模型组和针刺组，每组15只。采用改良Pulsinelli四血管阻断(4-VO) 法建立VD大鼠模型。模型组和针刺组麻醉后行背侧颈正中切口，用电凝针烧灼双侧第一颈椎横突翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞；再行腹侧颈正中切口，分离双侧颈总动脉，24 h后用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，5 min×3次，每次间隔1 h。对照组处理步骤同上，但不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭。针刺组在造模后，参照图谱定位，自制耳针刺激于“肾”、“心”耳穴，持续4 w。

1.2.2 行为学测试实验第4周进行Morris水迷宫实验。迷宫分为4个象限，在第Ⅲ象限置一个站台，没于水下2 cm。第1～6天行定向航行试验：将大鼠按Ⅰ～Ⅳ的顺序依次放入水中，记录大鼠60 s内从入水到爬上站台所需时间，即逃避潜伏期。第7天行空间探索试验：拆去站台，记录120 s内大鼠在原站台所在象限(Ⅲ象限)的游泳时间和穿越站台位置的次数。

1.2.3 免疫组化染色水迷宫实验后麻醉大鼠，自左心室插管灌注生理盐水和10%中性甲醛以固定鼠脑，经脱水、透明、石蜡包埋处理后，行鼠脑海马冠状位切片，片厚4～5 μm，每只大鼠切5张片。免疫组织化学SABC法检测海马齿状回ChAT的表达，操作严格按照说明书进行。每张切片取5个视野，每个视野采集一幅图像，计数ChAT免疫反应阳性细胞数及测定平价光密度值，取其平均值作为最后结果。

1.3 统计学方法应用SPSS13.0软件行单因素方差分析及S-N-K检验。

2结果

2.1 行为学测试定向航行试验中逃避潜伏期模型组大鼠较对照组大鼠明显延长(P<0.05)，而针刺组较模型组明显改善(P<0.05)。见表1。空间探索试验中大鼠穿越站台次数和第Ⅲ象限活动时间为：对照组(5.75±1.86)次和(49.27±6.53)s，模型组(1.00±0.64)次和(25.35±5.70)s，针刺组(3.35±1.20)次和(36.68±5.77) s；模型组与对照组比较(P<0.01)及针刺组与模型组比较(P<0.05)差异显著。

2.2 海马齿状回ChAT的表达 对照组大鼠海马齿状回颗粒细胞数目多、排列紧密，其中有大量ChAT阳性神经细胞分布，且胞质内有大量棕黄色阳性物质；细胞结构清楚，胞体较大呈圆形或椭圆形，有的可见神经元突起。模型组海马齿状回细胞严重脱失，细胞结构模糊，胞体固缩，染色较淡，ChAT阳性神经细胞数较对照组明显减少 (P<0.01)。针刺组阳性神经细胞数量较模型组增加(P<0.05)，细胞结构形态接近对照组。见图1和表2。

组别第1天第2天第3天第4天第5天第6天对照组43.54±6.2127.85±8.9024.76±6.1418.91±5.1513.40±5.5612.10±4.50模型组54.72±7.411)52.78±7.452)43.29±4.912)39.47±4.752)34.93±3.742)33.77±10.482)针刺组49.18±7.0735.76±4.594)31.81±5.993)28.06±5.414)25.53±3.674)22.36±8.554)

与对照组比较：1)P< 0.05, 2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05, 4)P<0.01

图1　各组大鼠海马齿状回ChAT阳性神经细胞(SABC,×400)

组别细胞计数(个/视野)平均光密度值对照组62.21±6.1984.56±7.61模型组30.62±3.261)170.06±11.931)针刺组40.03±2.762)149.61±3.762)

与对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05

3讨论

脑反复缺血再灌注损伤和长期慢性低灌流是VD的主要发病原因〔1〕。本实验采用国际公认的改良Pulsinelli 4-VO法，可逆性阻断颈总动脉血流并永久性灼断椎动脉，使大鼠脑处于长期低灌流状态，致脑功能严重受损，制备出近似人类临床发病特点的VD大鼠模型〔5〕。海马结构是参与学习和记忆功能的重要脑区，也是大脑极具可塑性但极易受损的一个脑区，对缺血缺氧极为敏感。美国心理学家Deutsch早在70年代初就提出“记忆胆碱能突触假说”：记忆突触就是胆碱能突触，是学习记忆的结构和生理基础〔6〕。海马内富含胆碱能神经纤维投射，当胆碱能神经元受损时，脑内学习记忆的神经生物学基础——海马环路就会受损，导致痴呆发生。乙酰胆碱作为神经递质存在于胆碱能神经元内，是迄今发现与学习记忆关系极为密切的一种神经递质〔7〕。 ChAT是细胞内催化乙酰胆碱合成的关键酶，与乙酰胆碱的分布几乎平行，常作为研究胆碱能神经元的标志或评估乙酰胆碱含量的间接指标〔8〕。本实验采用阳性细胞计数和平均光密度值两个指标来评价ChAT在海马齿状回的表达，其中平均光密度值代表的是阳性表达部位的透光程度，其值大小与目标物表达水平呈反比的关系。中医将VD归属于“中风”、“呆病”、“善忘”的范畴，认为肾虚髓空为本，血瘀痰浊为标〔4〕。祖国医学很早就认为，耳具有全身五脏六腑和肢体的缩影，带有整体信息。《证治准绳》中有“肾为耳窍之主，心为耳窍之容”。刺激耳穴“肾”具有益精血、补脑髓、畅活气血、固本培元之功；刺激耳穴“心”具有主血调神，疏通经脉、活血止痛之功；加之针灸治疗VD有多方面优势：降低血液黏度、促进侧支循环建立、改善脑缺血缺氧等作用〔3，9〕。本文结果表明针刺“肾”、“心”耳穴可改善VD大鼠学习记忆功能，可能与其促进ChAT在脑的表达、保护胆碱能神经元有关。

参考文献4

1姜彩肖,张丽梅,杭景仙.血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及发病机制〔J〕.中国老年学杂志,2009;29(15):1940-2.

2王玉梅,商亚珍.血管性痴呆的研究进展〔J〕.承德医学院学报,2011;28(3):319-22.

3吴伟伟,石海平,张庆萍.针刺治疗血管性痴呆的临床研究进展〔J〕.中国中医急症, 2012;21 (2): 252-3.

4陈刚,张六通,邱幸凡.血管性痴呆病机与治疗探讨〔J〕.现代中西医结合杂志, 2004;13(4): 545-7.

5Pulsinelli WA, Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanaesthetized rat〔J〕.Stroke, 1979; 10(3): 267-71.

6Deutsch JA.The cholinergic synapse and the site of memory〔J〕.Science, 1971;174(11)：788-94.

7Berger-Sweeney J. The cholinergic basal forebrain system during development and its influence on cognitive processes: important questions and potential answers〔J〕.Neurosci Biobehav Rev,2003;27(4):401-11.

8Lyness SA, Zarow C, Chwi HC,etal.Neuron loss in key cholinergic and aminergic nuclei in Alzheimercs disease: a meta-analysis〔J〕.Neurobiolaging, 2003;24(1): 1-23.

9曲姗姗,卢阳佳,黄泳,等.针灸治疗血管性痴呆的机制研究〔J〕.上海针灸杂志,2010;29(12):805-8.

〔2014-01-11修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

中图分类号〔〕R338.64〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6712-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.029