糖尿病视网膜病变患者氧化应激状态及炎症因子的临床研究

关清华　旷劲松　程岚　辛彩虹

[摘要] 目的 通过测定糖尿病视网膜病变（DR）患者血清晚期蛋白氧化产物（AOPP）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）及色素上皮衍生因子（PEDF）的水平，探讨其在DR中的可能作用。 方法 选择2型糖尿病（T2DM）患者90例，分为T2DM无DR（NDR）组30例，背景期DR（BDR）组30例，增殖期DR（PDR）组30例。同时选择健康对照组30例。用Wikto-sarsat介绍的方法改进后测定各组血清AOPP水平，酶联免疫吸附（ELISA）法测定血清VEGF及PEDF水平。 结果 随着DR的进展，各组血清中AOPP水平逐渐升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与正常对照组比较，2型糖尿病各组VEGF水平均显著升高（P<0.05）；BDR组及PDR组与NDR组比较，VEGF水平均明显高于NDR组（P<0.05）；但PDR组VEGF含量较BDR组有所下降（P<0.05）。各组血清中PEDF水平逐渐下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关分析表明血清VEGF与PEDF水平呈负相关（r=-0.734，P<0.05）；而血清AOPP与VEGF水平呈正相关（r=0.816，P<0.05），与PEDF水平呈负相关（r=-0.905，P<0.05）。 结论 糖尿病患者血清AOPP和VEGF水平的升高，PEDF水平的下降可能促进了DR的发生发展。

[关键词] 糖尿病视网膜病变；晚期蛋白氧化产物；血管内皮细胞生长因子；色素上皮衍生因子

[中图分类号] R587.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）35-0029-03

[Abstract] Objective By measuring the level of serum advanced oxidation protein products （AOPP）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and pigment epithelium-derived factor （PEDF） in patients with diabetic retinopathy（DR）， and to explore its possible role in the pathogenesis of DR. Methods 90 type 2 diabetes mellitus （T2DM） patients were divided into three groups： 30 patients with non-DR （NDR）， 30 patients with back ground-DR （BDR）， 30 patients with proliferative-DR （PDR）. At the same time， 30 healthy controls were selected. The concentration of serum AOPP was measured by modified Wikto-Sarsat， while VEGF and PEDF by ELISA assay. Results The serum level of AOPP increased gradually along with the development of DR， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Serum levels of VEGF in T2DM groups were significantly increased compared with the control group （P<0.05）， and VEGF in BDR and PDR groups were significantly higher than that in NDR group （P<0.05）， but the serum level of VEGF in PDR group was significantly lower than that in BDR group （P<0.05）. The serum level of PEDF in each group was gradually decreased， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that the serum level of VEGF was negatively correlated with PEDF（r=-0.734， P<0.05）. The serum level of AOPP was positively correlated with VEGF （r=0.816， P<0.05）， and negatively correlated with PEDF（r=-0.905， P<0.05）. Conclusion The increase of AOPP and VEGF level in serum of patients with diabetes， and the decrease of PEDF may promote the development of DR.

[Key words] Diabetic retinopathy； Advanced oxidation protein products； Vascular endothelial growth factor； Pigment epithelium-derived factor

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）作为一种渐进性疾病，是糖尿病最严重的微血管并发症之一，可导致不可逆性失明，是致盲的主要原因之一，然而关于DR的确切发病机制目前仍未完全明了。现一致认为氧化应激状态是糖尿病慢性并发症发生发展的共同土壤，长期高血糖及其引起的眼部组织氧化应激状态使血管生成的促进因子表达增加，并减少抑制因子的表达，使血管生成调节失衡，最终导致DR。本文测定了DR患者氧化应激指标血清晚期蛋白氧化产物（advanced oxidation protein products，AOPP）、炎症因子血清血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）的水平，以探讨其在DR中的可能作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

根据2010年WHO糖尿病诊断标准选择我院2014年7月～2015年7月内分泌科住院2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者共90例，其中60例按照全国眼底病协作组制定的DR诊断标准，根据眼底散瞳和眼底荧光素血管造影确诊为DR患者为DR组。其中背景期DR组（back ground-DR，BDR）30例。男16例，女14例；年龄（53.16±5.8）岁；增殖期DR组（proliferative-DR，PDR）30例。男15例，女15例，平均年龄（57.2±7.9）岁。无DR组（non-DR，NDR）30例。男17例，女13例，平均年龄（55.72±7.2）岁。所用病例均排除心脑血管疾病、高血压、肝肾功能不全、恶性肿瘤及急慢性感染等。患者进入研究前1个月内未应用抗氧化剂如硫辛酸、维生素C及维生素E等。随机挑选我院体检中心年龄相匹配的健康志愿者30名为正常对照（NC）组，经口服葡萄糖耐量试验证实排除糖尿病。男15例，女15例，平均年龄（54.91±6.7）岁。双眼散瞳检测眼底正常。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 全部受试者均于清晨空腹采静脉血2 mL，室温静置1 h，离心10 min（2000 r/min），取血清避光保存于-70℃冰箱待测，所用标本一次测定。

1.2.2 观察指标 所用患者均常规计算体重指数及检测空腹血糖，应用Witko-sarsat提出的分光光度计法[1]加以改进检测AOPP，按照试剂盒说明书检测VEGF及PEDF。

1.2.3 测定方法 按Witko-sarsat提出的分光光度计法[1]加以改进，血清与PBS按1：5稀释，以氯胺-T同法稀释作空白对照，加入10 μL 1.1 6 mol/L KI及20 μL乙酸后立即测340 nm处的吸光度（A）值。AOPP浓度以氯胺-T含量表示。VEGF及PEDF的测定采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法，试剂盒分别由深圳晶美生物工程有限公司及美国TSZ公司提供。

1.3 统计学处理

采用SPSS12.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析判断组间差异，两参数间相关性检验应用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料及血清AOPP、VEGF及PEDF水平比较

NC组、NDR组、BDR组及PDR组的年龄、性别、体重指数差异均无统计学意义（P>0.05）。T2DM各组（包括NDR组、BDR组、PDR组）血糖均高于正常对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；而T2DM各组间比较，则差异无统计学意义（P>0.05）。随着DR的进展，各组血清中AOPP水平逐渐升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与正常对照组比较，T2DM各组VEGF水平均显著升高（P<0.05）；BDR组及PDR组与NDR组比较，VEGF水平均明显高于NDR组（P<0.05）；但PDR组VEGF含量较BDR组有所下降（P<0.05）；各组血清中PEDF水平逐渐下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 相关性分析

血清VEGF与PEDF水平呈负相关（r=-0.734，P<0.05）；而血清AOPP与VEGF水平呈正相关（r=0.816， P<0.05），与PEDF水平呈负相关（r=-0.905，P<0.05）。

3 讨论

1型和2型糖尿病均可进展为DR，几乎每个1型糖尿病经过15～20年的时间均进展为DR，而T2DM超过60%进展为DR。在发达国家DR是成人视力缺损的主要原因[2]。现一致认为，DR与自由基介导的氧化损伤有关[3]。机体中氧化自由基产物增加或抗氧化剂及抗氧化酶活力下降，导致自由基的生成与机体抗氧化能力间失衡，导致视网膜组织氧化应激发生。大量研究表明增加的氧化应激是糖尿病患者视网膜炎症反应的一个主要原因[4]，活性氧通过改变多种炎症基因表达从而在介导炎症反应方面起到重要作用，最终引起视网膜损伤导致DR的发生。糖尿病时，高血糖诱导的氧化应激明显增强[5]，自由基可作用于蛋白、脂肪及核酸等，形成各种损伤产物，从而影响正常的生理过程。AOPP反映了氧化应激造成的蛋白质损伤，尤其对白蛋白的损伤，是蛋白质被单核细胞、中性粒细胞活化生成的次氯酸所修饰的产物，是反应蛋白氧化程度的敏感指标[6]。研究表明，T2DM患者的AOPP水平较健康对照组明显升高，而在T2DM合并DR患者的血清中AOPP水平明显高于无DR的患者[7]。本研究表明随着DR的进展，氧化应激反应逐渐增强，表现为AOPP水平逐渐升高，各组间比较有统计学意义，亦进一步支持上述结果。

VEGF是目前已知的最强的内皮细胞有丝分裂原和诱导血管生成的细胞因子[2，8]，也是目前认为与DR新生血管形成联系最密切的一个细胞因子，其特异性地直接作用于血管内皮细胞，刺激血管生长的因子，其他各种因素刺激血管生成的作用都是直接或间接通过诱导VEGF及其受体的表达来实现的，然而在糖尿病视网膜中这些新生血管脆性强，很容易破裂。Zhang等[9]表明VEGF在玻璃体液中的水平和糖尿病视网膜病变的严重程度密切相关。本研究结果表明，随着DR的加重，血清VEGF水平呈现递增趋势。但PDR组血清VEGF水平较BDR组下降，分析其原因可能为：BDR期由于机体高血糖及代谢紊乱，导致组织缺氧，刺激VEGF分泌增多，而进展到PDR期，大量新生血管形成使得缺氧的压力减轻，同时有部分新生血管破裂，则VEGF产生也随之减少，这表明血清中VEGF水平与糖尿病患者新生血管活动性密切相关。当新生血管活动期结束，VEGF水平则下降。有研究表明抗VEGF治疗可有效延缓DR的发展[10]，Porta等[11]研究表明对存在黄斑水肿的DR患者应用抗VEGF治疗可以有效治疗DR。

PEDF是一种具有多种功能的蛋白质，在视网膜及神经系统中表达最多，被称为“天然血管抑制因子”，通过抑制NADPH氧化酶介导的氧化应激而起到阻止神经损伤及降低血管通透性等作用，还可以抑制新生血管生成，从而阻止DR发生发展[12、13]。本研究结果表明随着DR的进展，各组血清PEDF水平逐渐下降，各组间比较有统计学意义。这表明血清PEDF水平的下降可能是DR病程进展的一个重要原因。补充PEDF及各种促进PEDF表达的方法均可能为延缓DR病变的发展提供有效治疗[14，15]。

相关分析表明，血清VEGF与PEDF水平呈负相关（r=-0.734，P<0.05），这说明VEGF可在一定程度下调PEDF表达，进一步促进DR的进展；同时有研究表明PEDF通过拮抗VEGF的生物学作用而抑制视网膜血管通透性[13]，从而阻止DR的发生发展。而血清AOPP与VEGF水平呈正相关（r=0.816，P<0.05），与PEDF水平呈负相关（r=-0.905，P<0.05），这说明氧化应激损伤产物可能会通过上调VEGF及下调PEDF水平，从而破坏血清VEGF与PEDF之间的平衡，参与DR的发生发展。

综上所述，氧化应激状态及增加的蛋白氧化损伤与炎症反应在DR形成过程中起到重要作用，即当糖尿病患者血清AOPP和VEGF水平升高，PEDF水平下降时可能促进了DR的发生发展。由于DR早期缺乏典型症状，晚期尚无特效药物治疗，通常在患者发现视觉异常时已失去了最佳治疗时机，而通过联合检测血清AOPP、VEGF、PEDF水平有助于明确DR严重程度，为临床有效防治DR提供依据，具有广阔的应用前景。

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（收稿日期：2015-09-17）