柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株1869的T-DNA插入位点侧翼序列的克隆

许沛冬，郑肖兰，赵艳，李秋洁，吴伟怀，贺春萍，习金根，

梁艳琼2，郑金龙2，戚山江1，张晓波4,5*，易克贤2,3*

(1.海南大学农学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 海口 571101；3.中国热带农业科学院

热带生物技术研究所，海南 海口 571101；4.热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室(海南大学)，

海南 海口 570228；5.海南大学旅游学院，海南 海口 570228)

柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株1869的T-DNA插入位点侧翼序列的克隆

许沛冬1,2，郑肖兰2，赵艳1，李秋洁2，吴伟怀2，贺春萍2，习金根2，

梁艳琼2，郑金龙2，戚山江1，张晓波4,5*，易克贤2,3*

(1.海南大学农学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 海口 571101；3.中国热带农业科学院

热带生物技术研究所，海南 海口 571101；4.热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室(海南大学)，

海南 海口 570228；5.海南大学旅游学院，海南 海口 570228)

摘要：通过对实验室已构建的柱花草炭疽菌T-DNA突变体库中各转化子致病力的测定，获得致病力丧失突变菌株1869。对其进行PCR检测以验证T-DNA在1869基因组中插入情况，并测定观察其菌落直径、菌落形态及产孢量等生物学特性，利用TAIL-PCR克隆标记基因侧翼序列，采用生物信息学方法比对基因信息。结果表明，与柱花草炭疽菌野生型菌株CH008相比，突变菌株1869表现致病力丧失，菌落生长速率也显著低于野生型；然而，在分生孢子形态、产孢能力、孢子萌发率等方面与野生型并无明显差异。TAIL-PCR扩增得到T-DNA插入位点RB端序列467 bp，LB端侧翼序列388 bp，经两侧序列拼接比对，所得序列与Pac1同源性达到92%~96%，推测可能由于基因表达产物调节菌株对pH值的敏感性，从而影响了其致病过程。

关键词：柱花草；炭疽菌；T-DNA；致病力；基因克隆

DOI：10.11686/cyxb2015094http://cyxb.lzu.edu.cn

许沛冬，郑肖兰，赵艳，李秋洁，吴伟怀，贺春萍，习金根，梁艳琼，郑金龙，戚山江，张晓波，易克贤. 柱花草炭疽菌致病力丧失突变菌株1869的T-DNA插入位点侧翼序列的克隆. 草业学报, 2015, 24(8): 142-149.

Xu P D, Zheng X L, Zhao Y, Li Q J, Wu W H, He C P, Xi J G, Liang Y Q, Zheng J L, Qi S J, Zhang X B, Yi K X. Molecular characterization of the flanking gene of T-DNA insertional, pathogenicity-defectiveColletotrichumgloeosporioidesmutant strain 1869. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 142-149.

收稿日期：2015-02-20；改回日期：2015-03-30

基金项目：国家自然科学基金(31072076,31101408),公益性行业科研专项(201303057)和中央级公益性科研院所基本科研业务专项(2015hzs1J002)资助。

作者简介：许沛冬(1990-)，男，内蒙古集宁人，在读硕士。E-mail：xuridongshengxpd@163.com

通讯作者*Corresponding author. E-mail：yikexian@126.com, angiaoo@126.com

Molecular characterization of the flanking gene of T-DNA insertional, pathogenicity-defectiveColletotrichumgloeosporioidesmutant strain 1869

XU Pei-Dong1,2, ZHENG Xiao-Lan2, ZHAO Yan1, LI Qiu-Jie2, WU Wei-Huai2, HE Chun-Ping2, XI Jin-Gen2, LIANG Yan-Qiong2, ZHENG Jin-Long2, QI Shan-Jiang1, ZHANG Xiao-Bo4,5*, YI Ke-Xian2,3*

1.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Haikou570228,China; 2.EnvironmentandPlantProtectionInstitute,CATAS,Haikou571101,China; 3.InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,CATAS,Haikou571101,China; 4.KeyLaboratoryofProtectionandDevelopmentUtilizationofTropicalCropGermplasmResources(HainanUniversity),MinistryofEducation,Haikou570228,China; 5.CollegeofTourism,HainanUniversity,Haikou570228,China

Abstract:Colletotrichum gloeosporioides is a fungal pathogen of Stylosanthes guianensis causing anthracnose disease. Pathogenicity defective mutant strains of C. gloeosporioides were screened in the laboratory and strain 1869 selected for study. The mutant strain was compared with wild type strain CH008 for phenotypic characteristics, including colony diameter, colony morphology, sporulation ability and spore germination rate. Colony diameter of CH008 and strain 1869 differed, but the other traits did not. DNA of the mutant strain was extracted, and using thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) a T-DNA insertion mutation site believed responsible for loss of pathogenicity was identified. The RB and LB flanking sequences at the insertion site were cloned, also using TAIL-PCR. The RB flanking sequence was 467 bp in length, while the LB flanking sequence was 388 bp. The BLAST result showed that the sequence had 92%-96% homology to gene Pac1. By predicting the function of a protein coded by the flanking sequence,we inferred that the gene in question regulated the sensitivity to pH, and in this way affected the pathogenic potential of C. gloeosporioides.

Key words:Stylosanthes guianensias; Colletotrichum gloeosporioides; T-DNA; pathogenicity; gene clone

柱花草(Stylosanthesguianensis)是广泛种植于热带、亚热带地区的优质豆科牧草，在我国有“北有苜蓿(Medicago)，南有柱花草”的美誉，被称为“热带牧草之王”[1-2]。柱花草炭疽病是影响柱花草产量的重要病害，其主要由病原真菌胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起，病原菌可侵染柱花草叶片、叶柄、茎秆乃至花序等各个部位，且存在高度的遗传变异性及生物多样性[3-4]。炭疽菌危害的植物种类繁多，包括各类木本、草本植物，直到近年来，仍有炭疽菌感染新的植物的报道，如当归(Angelicasinensis)[5]等。对于炭疽病的防治而言，在化学防治及抗病品种的选育遭遇巨大的瓶颈后，众多的学者将目光投向于对病原菌致病相关基因的分离与研究，以期望了解病原菌的侵染及致病机制，而根癌农杆菌介导遗传转化(Agrobacteriumtumefaciensmediated transformation， ATMT)的T-DNA 插入突变技术即成为了研究致病相关基因的有效手段[6-8]。自1995年，Bundock 等[9]首次利用根癌农杆菌成功介导酵母菌遗传转化以来，ATMT法已经在构建真菌的突变体库中取得了巨大的进展。在炭疽菌方面，有关专家学者先后对黄瓜(Cucumissativus)[10]、香蕉(Musanana)[11]、芒果(Mangiferaindica)[12]等遗传转化体系进行研究，本实验室胡彩平等[13]对柱花草炭疽菌进行了遗传转化体系的优化。利用ATMT，国内外学者纷纷筛选得到了部分炭疽菌致病相关基因，如Stephenson等[14]获得了CgDN3基因，该基因在侵染寄主的活体营养阶段表达；Thon等[15]获得了CPR1基因，其为编码信号肽基因。但柱花草炭疽菌的致病相关基因尚未有报道。

本试验对筛选得到的柱花草炭疽菌致病力丧失菌株1869进行了生物学性状的分析，用分子生物学手段分析1869菌株T-DNA的序列插入位点，通过TAIL-PCR技术克隆侧翼序列，对该序列在炭疽病菌致病过程的作用进行分析，希望能够为柱花草炭疽病致病相关基因的克隆和研究提供一定的理论基础，为柱花草炭疽病的致病机理以及防治策略提供一定的分子参考依据。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1菌株参试菌株包括野生型菌株CH008以及突变菌株1869。其中CH008为实验室分离获得的强致病力炭疽菌株[16]，突变菌株1869则是由柱花草炭疽菌野生型菌株CH008通过农杆菌介导遗传转化(ATMT)的T-DNA 插入获得的致病力丧失突变体。所用根癌农杆菌菌株为AGL-1，该菌内含pSULF.gfp质粒，以pCAMBIAl300为骨架，含有氯嘧磺隆抗性标记基因ILV1以及报告基因GFP的二元载体[17]。菌株均保存于实验室-70℃冰箱。

1.1.2培养基及主要仪器Luria-Bertani培养基(LB)：蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，NaCl 8.0 g，Agar 20 g，补充ddH2O至1000 mL，pH值7.0。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA)：马铃薯 200 g，葡萄糖 15~20 g，琼脂 15~20 g，补充ddH2O至1000 mL。其对应液体培养基则不加琼脂。

主要仪器：HZO-F160型全温振荡培养箱，Eppendorf 5333型梯度PCR仪，LDZX-75KB高压蒸汽灭菌锅，OLYMPUS U-RFL-T型荧光数码生物显微镜，721型分光光度计，便携式CP-401型pH计。

1.1.3引物与主要试剂试验所用引物名称及序列见表1。引物合成由上海英潍捷基及英骏生物技术公司完成，测序工作由上海立菲生物技术有限公司完成。DNA Maker、Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司。Fungle gDNA Kit 购于Biomiga公司；Plasmid Mini Kit I购于Omega公司；pEASY-T1 Cloning vector、E.colitrans T1，购自于北京全式金生物技术有限公司。

1.1.4试验时间2014年8月至12月于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所完成全部试验内容。

1.2　试验方法

1.2.1突变菌株致病力分析突变体菌株致病力测定采用菌饼反接离体叶片法。柱花草选用炭疽病易感病品种格拉姆，于2014年8月，柱花草生长旺盛时期选取叶龄7 d左右的柱花草三出复叶，针刺叶片，将菌饼接种在叶片上(菌丝面紧贴伤口)，设置2个对照，野生型CH008及空白PDA培养基饼块。将叶片放置在培养盘中，设3个重复，盘内进行保湿处理，保鲜膜封口，28℃恒温培养5 d，观察叶片发病情况。

1.2.2T-DNA插入稳定性PCR检测2014年8月，将菌株于PDA培养基上活化，28℃恒温培养6 d，收集孢子及菌丝，于PDA液体培养基中，28℃ 180r/min振荡培养4 d，灭菌纱布过滤收集菌丝，冷冻干燥过夜。使用Fungle gDNA Kit提取DNA，方法参照说明书进行。根据T-DNA含有氯嘧磺隆抗性标记基因ILV1以及报告基因GFP的二元载体设计引物GFP1、GFP2(表1)。以GFP1、GFP2为引物，CH008、1869的DNA为模板进行PCR检测。反应体系为2.0 μL 10×Buffer，1.2 μL dNTPs，引物(20 μmol/μL)各0.5 μL，0.2 μL Taq酶，1 μL DNA模板，灭菌去离子水补齐体系20 μL。反应程序为94℃预变性4 min； 94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s， 35次循环；72℃延伸5 min。PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，于凝胶成像系统中拍照。

注： W=A或T，S=G 或 C，N=A、T、G或C。

Note: W=A or T；S=G or C；N=A,T,G or C.

1.2.3突变菌株生物学性状分析挑取保存的野生型菌株CH008及突变菌株1869于PDA培养基上划线活化，28℃恒温培养6 d。在菌落边缘用打孔器打取菌饼(直径为0.5 cm)，用以完成突变体生物学性状的分析测定。所有试验于2014年9月完成，以下每个处理设置3个重复，所得数据用Excel整理，采用DPS(7.05)统计软件进行分析，用Tukey法进行多重比较。

1) 菌落形态的观察及生长速率的测定。将上述菌饼接种于直径为9 cm培养皿的PDA平板中央，28℃恒温培养6 d后测量菌落直径并观察菌落形态。

2) 孢子形态的观察及产孢能力的测定。取5块菌饼接种至150 mL的PDA液体培养基中，在28℃下180 r/min振荡培养6 d，用灭菌纱布过滤获得孢子悬浮液。用血球计数板计算产孢量并观察孢子形态及大小。

3) 孢子萌发的测定。调节孢子悬浮液浓度为1.0×105个/mL，取30 μL滴于干净的载玻片上，将载玻片放置在吸水饱和的滤纸上做保湿处理，6~8 h 后观察孢子萌发，24 h观察附着胞的形成。

1.2.4突变菌株侧翼序列的克隆利用交错式热不对称PCR方法(thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)克隆1869插入位点的侧翼序列。随机引物、特异性嵌套引物设计参考Mullins等[18]、Combier等[19]的相关方法，详见表1。其中随机引物包括AD1、AD2、AD3、AD4、AD8、AD9；特异性嵌套引物RB1/RB2/RB3扩增插入T-DNA片段RB端侧翼序列，LB1/LB2/LB3扩增插入T-DNA片段LB端侧翼序列。TAIL-PCR共包含3轮反应，第1轮反应以DNA为模板进行，用量1 μL；第2轮及第3轮反应以前一轮PCR产物稀释100倍为模板，用量2 μL，反应体系及程序参考Mullins等[18]的方法进行。

1.2.5扩增产物的克隆及目的片段的测序与分析利用pEASY-T1 Cloning Kit对PCR产物进行克隆，按照说明书将PCR产物连接到pEASY-T1载体上，加连接产物于感受态细胞中。在含有IPTG 和X-gal 的LB(Amp+)平板上，根据蓝白斑筛选方法挑取白色菌落。利用PCR方法检测阳性克隆。使用Plasmid Mini Kit I对克隆产物提取质粒，将质粒送上海立菲生物技术有限公司测序。根据测序结果，分析T-DNA插入位点侧翼序列，采用NCBI网站BLAST程序完成序列相似性的比对和分析。

2结果与分析

2.1　突变菌株的致病力分析

将突变菌株1869、野生型菌株CH008菌饼以及空白PDA培养基饼块反接离体叶片。28℃恒温培养5 d。结果显示(图1)，野生型菌株CH008反接的离体柱花草叶片有明显褐色病斑，且病斑范围从叶片延伸到叶柄；突变菌株1869及空白PDA培养基反接的离体柱花草叶片无病斑产生。重复试验，且多代培养突变菌株1869进行试验，结果相同。即突变菌株1869致病力丧失。

2.2　T-DNA插入稳定性PCR检测

提取突变菌株1869、野生型菌株CH008的基因组DNA，以GFP1、GFP2为引物，进行PCR检测，结果显示(图2)，以突变菌株1869的DNA为模板，扩增得到约750 bp的T-DNA特异条带；以野生型菌株CH008的基因组DNA为模板未得到条带。即说明T-DNA稳定插入到1869的基因组中。

图2　突变菌株1869的分子检测Fig.2　The molecular detection of mutant strain 1869

2.3　突变菌株生物学性状分析

测定观察突变菌株1869的菌落直径、菌落形态及产孢量等生物学特性，以野生型CH008为对照，并利用数据分析统计软件进行差异显著性分析。结果表明，与野生型CH008菌株相比，突变菌株1869生长速率及菌落直径存在显著性差异(图3A、表2)，CH008菌丝生长稠密，生长速率较快，在PDA平板培养6 d，菌落直径可达(7.18±0.11) cm，且可以观察到菌丝下有大量分生孢子产生；突变菌株1869在菌落形态上无明显差异，但生长速率较慢，培养6 d，菌落直径为(5.53±0.18)cm，也可观察到分生孢子产生。

将突变菌株1869和野生型菌株CH008接种至PDA液体培养基中，28℃、180 r/min振荡培养6 d，以获得孢子悬浮液。用血球计数板计算产孢量并观察孢子形态及大小。结果表明，1869与CH008的孢子形态均表现为长柱形或短棒形，无显著性差异；在产孢量方面，无显著性差异(图3B、表2)，PDA液体培养基培养6 d，均有分生孢子产生，CH008产孢量为(6.13±2.52)×106个/mL，1869产孢量为(3.43±0.85)×106个/mL。由此推测，T-DNA插入突变菌株1869的位点并不能导致分生孢子的变化，无论野生型菌株还是突变体菌株均表现为产生大量分生孢子，以有利于病原菌对寄主的迅速侵染、致病。

在对1869与CH008的孢子悬浮液进行孢子萌发的观察发现(图3C、表2)，8 h后CH008孢子萌发率为(89.79±1.40)%，1869的孢子萌发率为(93.30±0.68)%，二者无显著性差异，24 h观察附着胞的形成，1869与CH008均未产生附着胞。即T-DNA插入突变菌株1869的位点并不是通过影响孢子萌发来导致致病力的丧失。

图3　致病力丧失突变体菌株1869的生物学性状 Fig.3　The phenotypes of pathogenicity-defective mutant strain 1869　A:菌株在PDA培养基上的形态Phenotypic analysis diameters on PDA medium；B：菌株的产孢量Statistical analysis of conidia production；C：菌株的孢子萌发情况Spore germination of pathogenic mutants.左：野生型菌株CH008；右：突变体菌株1869。 Left: mutant strain 1869；Right: wild type strain CH008.

2.4　突变菌株侧翼序列的克隆

利用TAIL-PCR方法克隆1869插入位点的侧翼序列。通过对随机引物的筛选，得知扩增1869 T-DNA插入位点的有效随机引物左翼和右翼均为AD9，以随机引物AD9、特异性嵌套引物RB1/RB2/RB3扩增插入T-DNA片段RB端侧翼序列，得到长度约500 bp的特异序列(图4)；以随机引物AD9、特异性嵌套引物LB1/LB2/LB3扩增插入T-DNA片段LB端侧翼序列，得到长度约400 bp的特异序列(图4)。

图4　突变菌株1869 TAIL-PCR扩增结果Fig.4　The TAIL-PCR amplification results of mutant strain 1869　　　M：Maker；L-2/ R-2:第2轮左翼/右翼序列The LB or RB flanking sequence of No.2；L-3/R-3：第3轮左翼/右翼序列The LB or RB flanking sequence of No.3.

2.5　扩增产物的克隆及目的片段的测序与分析

对TAIL-PCR扩增产物进行克隆，在含有IPTG和X-gal 的LB(Amp+)平板上，根据蓝白斑筛选方法挑取白色菌落，经PCR方法检测，所得菌落为阳性克隆。对克隆产物提取质粒，将质粒送上海立菲生物技术有限公司测序，测序结果显示，克隆得到RB端侧翼序列467 bp， LB端侧翼序列388 bp。对序列进行拼接(图5)，采用NCBI网站BLAST程序完成序列相似性的比对，结果显示，所得序列与炭疽菌环境pH应答转录调控因子基因Pac1同源性达到92%~96%。

表2　菌株1869与CH008的生物学性状差异显著性

注：小写字母表示菌株在0.05水平上的差异显著性；大写字母表示菌株在0.01水平上的差异显著性。

Note: Small letters represent the statistic difference at 0.05 level; capital letters indicate the statistic difference at 0.01 level.

图5　突变菌株1869 T-DNA插入位点侧翼序列的克隆与分析Fig.5　The molecular clone and analysis of the T-DNA flanking sequences of mutant strain 1869

3结论与讨论

真菌对植物的侵染方式各不相同，而对于炭疽菌属真菌侵染初期主要为分生孢子附着在寄主的表面，以及分生孢子萌发产生芽管，而后分化成为形态各异的附着胞[20]；当其穿透寄主表皮后，则主要包括细胞内半活体营养型、角质层内死体营养型[21]。也就说明，生物学性状方面的变异，可能直接导致炭疽菌对于寄主的侵染[22]；另一方面，致病力丧失突变体的致病力变化也可能导致某些生物学特性的差异。在本研究中，与野生型菌株CH008相比，突变菌株1869表现致病力丧失，其菌落在生长速率及菌落直径上具有显著性差异；在形态、产孢能力、孢子萌发与野生型无明显差异。由此说明，突变菌株1869 T-DNA插入位点可能引起了菌株生长速率的变化，但未插入影响其产孢量、孢子萌发率、附着胞产生的关键基因中。

利用农杆菌介导遗传转化法(ATMT)获得突变体菌株，以鉴定突变菌株的变异情况，分析其基因变化，目前在国内外都取得了极大的进展，通过T-DNA插入位点标记基因的分析，各国学者已经成功获得了炭疽菌致病相关基因CgDN3[14]、CPR1[15]、CPR1[23]、PKSI[24]等，但尚未在柱花草炭疽菌中获得任何相关基因。本研究利用ATMT法获得的突变体菌株1869通过PCR检测，可知T-DNA稳定插入到1869相关基因中。TAIL-PCR方法被广泛应用于未知侧翼序列的扩增与克隆，而利用最适的随机引物是扩增成功的关键[25]。在本研究中，扩增1869 T-DNA插入位点的有效随机引物左翼和右翼均为AD9，并且成功克隆得到RB端侧翼序列467 bp， LB端侧翼序列388 bp。

在本研究中，对克隆得到的侧翼序列进行拼接，采用NCBI网站BLAST程序完成序列相似性的比对，结果显示，所得序列与炭疽菌环境pH应答转录调控因子基因Pac1同源性达到92%~96%。Pac1基因最早由Miyara等[26]在鳄梨胶孢炭疽菌中发现，并且经研究，敲除Pac1基因可下调pelB基因，而pelB基因表达裂解酶直接影响到菌株的毒力作用；此外Pac1基因可编码pacC转录因子，可调节菌株对pH的敏感性。有关学者[27-28]曾对pH值对柱花草炭疽菌的生长影响进行测定，研究发现柱花草炭疽菌可生长的pH值为3.0~14.0，最适生长pH值为6.4~7.2，在一定的范围内，随pH值的升高，炭疽菌产孢量减少，但菌丝生长量增加。说明pH值确定对柱花草炭疽菌的生长具有一定的影响，且可以通过对Pac1基因的研究达到炭疽菌致病力减弱或丧失的效果。后续，将深入展开柱花草炭疽菌中Pac1基因的研究，分析其基因功能，为柱花草炭疽病的防治，奠定一定的分子理论依据。

References：

[1]Liu F M, Cui X D, Wu K R,etal. Biological characteristics ofColletotrichumgloeosporioidesPenz. causing anthracnose ofStylosanthesguianensis. Guangdong Agricultural Science, 2012, 16: 65-68.

[2]Yi K X. Development and prospects and countermeasures on tropical forage industrial production in China. Chinese Journal of Tropical Agriculture, 2001, 4: 30-34.

[3]Jiang C S, Zhou D M, Zhang Z Y. Stylo anthracnose and the progress of its breeding for resistance to disease. Journal of Sichuan Grassland, 2002, (1): 22-27.

[4]Chakraborty S, Perrott R, Charchar M J D,etal. Biodiversity, epidemiology and virulence ofColletotrichumgloeosporioides.Ⅱ.Genetic and pathogenic diversity in isolates ofColletotrichumgloeosporioidesfrom eight species of stylosanthes.Tropical Grasslands, 1997, 31: 393-401.

[5]Bian J, Chen T X, Chen X R. Pathogen identification and occurrence regularity of a novel disease——Angelicaanthracnose.Acta Prataculture Sinica, 2014, 23(6): 266-273.

[6]Chen X L, Yang J, Peng Y L. Large-scale insertional mutagenesis inMagnaportheoryzaebyAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation. Methods in Molecular Biology, 2011, 722: 213-224.

[7]Liu P J, Wang Z Y, Wang Q H,etal.Agrobacteriumtumefaciensmediated transformation ofMagnaporthegriseaand identification of pathogenicity defective mutant. Chinese Journal of Rice Science, 2006, 20(3): 231-237.

[8]Yu M N, Hu J K, Huang L,etal. Molecular characterization of T-DNA integration of theUstilaginoideavirensMutant 5062. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(9): 1790-1798.

[9]Bundock Paul, Dulk-Ras Amkeden, Beijersbergen Alice G M,etal. Trans-kingdom T-DNA transfer fromAgrobacteriumtumefaciensto saccharomyces cerevisiae. The EMBO Journal, 1995, 14(3): 3206-3214.

[10]Fang L, Liu H Q, Song F M,etal.Agrobacteriumtumefaciensmediated transformation ofColletotrichumlagenariumthe causal agent of cucumber anthracnose. Journal of Zhejiang University(Agriculture and Life Sciences), 2006, 32(4): 360-366.

[11]Zhen D X, Li M H, Jiang Z D.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation ofColletotrichummusae. Journal of Zhongkai Agrotechnical College, 2005, 18(4): 42-44.

[12]Li W, Zheng X L, He C P,etal. Establishment ofAgrobacterium-mediated transformation systems forColletotrichumgloeosporioides. Plant Protection, 2008, 34(1):76-81.

[13]Hu C P, Zheng J L, Gao J M,etal. Optimization of genetic transformation system of StyloAnthracnosemediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.Chinese Journal of Tropical Crops, 2013, 34(6): 1007-1012.

[14]Stephenson S A, Hatfield J, Rusu A G,etal.CgDN3: An essential pathogenieity gene ofColletotrichumgloeosporioidesnecessary to avert a hypersensitive-like response in the hostStylosanthesguianensis. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2000, 13: 929-941.

[15]Thon M R, Nuekles E M, Takaeh J E,etal. CPR1: A gene encoding a putative signal peptidase that functions in pathogenicity ofColletotrichumgraminicolato maize. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2002, 15: 120-128.

[16]Yi K X, Huang J S, Liu G D. Genetic diversity analysis of Chinese Stylo anthracnose pathogens using random amplified polymorphic DNA.Acta Microbiologica Sinica, 2003, 43(3): 379-387.

[17]Gao J M, Hu C P, Zheng J L,etal. Construction and analysis of a T-DNA insertional mutant library forColletotrichumgloeosporioides. Guangdong Agricultural Science, 2014, 19(10): 142-145.

[18]Mullins E D, Chen P X, Romaine P,etal.Agrobacterium-mediated transformation ofFusariumoxysporum: An efficient tool for inserlional mutagenesis and gene transfer. Phytopathology, 2001, 91: 173-180.

[19]Combier J P, Melayah D, Raffier C,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation as a tool for insertional mutagenesis in the symbiotic ectomycorrhizal fungus Hebeloma Cylindrosporum.FEMS Microbiology Letters, 2003, 220(1): 141-148.

[20]Liu M, Zhang W, Zhou Y,etal. Research progress on grape anthracnose. China Plant Protection, 2014, 34(1): 29-33.

[21]Wharton P S, Julian A M. A cytological study of compatible and incompatible interactions betweenSorghumbicolorandColletotrichumsublineolum. New Phytologist, 1996, 134(1): 25-34.

[22]Kim Y K, Wang Y H, Liu Z M,etal. Identification of a hard surface contact-induced gene inColletotrichumgloeosporioidesconidia as a sterol glycosyl transferase, a novel fungal virulence factor. The Plant Journal, 2002, 30: 177-187.

[23]Thon M R, Nuckles E M, Takach J E,etal. CPRl: A gene encoding a putative signal peptidase that functions in pathogenicity ofColletotrichumgraminicolato maize. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2002, 15: 120-128.

[24]Tsuji G, Fujii S, Tsuge S,etal. TheColletotrichumlagenariumSte12-Like gene CSTl is essential for appressorium penetration. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2003, 16: 315-325.

[25]Sun B Y, Piao H L, Park S H,etal. Selection of optimal primers for TAIL-PCR in identifying Ds flanking sequences from Ac/Ds insertion rice lines. Chinese Journal of Biotechnology, 2004, 20(6): 821-826.

[26]Miyara I, Shafran H, Haimovich H K,etal. Multi-factor regulation of pectate lyase secretion byColletotrichumgloeosporioidespathogenic on avocado fruits. Molecular Plant Pathology, 2008, 9(3): 281-291.

[27]Zhang C C, Liang Y C, Meng J R,etal. Identification and biological character research on anthracnose ofStylosanthesspp. Journal of Guangxi Agricultural University, 1998, 17(1): 87-91.

[28]Feng S F, Li F E, He C Z,etal. Bionomics and epidemiology of anthracnose onStylosanthesspp. Chinese Journal of Tropical Crops, 1994, 15(1): 90-93.

参考文献：

[1]刘凤民, 崔晓东, 伍康荣, 等. 柱花草炭疽菌生物学特性的研究. 广东农业科学, 2012, 16: 65-68.

[2]易克贤. 我国热带牧草产业化的发展现状、前景与对策. 热带农业科学, 2001, 4: 30-34.

[3]蒋昌顺, 邹冬梅, 张正义. 柱花草炭疽病及其抗病育种研究进展. 四川草原, 2002, (1): 22-27.

[5]卞静, 陈泰祥, 陈秀蓉. 当归新病害——炭疽病病原鉴定及发病规律研究. 草业学报, 2014, 23(6): 266-273.

[7]刘朋娟, 王政逸, 王秋华, 等. 农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选. 中国水稻科学, 2006, 20(3): 231-237.

[8]俞咪娜, 胡建坤, 黄磊, 等. 稻曲病菌T-DNA插入突变体5062的插入位点分析. 中国农业科学, 2013, 46(9): 1790-1798.

[10]方丽, 刘海青, 宋凤鸣, 等. 农杆菌介导的黄瓜炭疽菌遗传转化. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2006, 32(4): 360-366.

[11]曾大兴, 李敏慧, 姜子德. 根癌农杆菌介导的香蕉炭疽菌转化. 仲恺农业技术学院学报, 2005, 18(4): 42-44.

[12]李伟, 郑肖兰, 贺春萍, 等. 根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立. 植物保护, 2008, 34(1): 76-81.

[13]胡彩平, 郑金龙, 高建明, 等. 根癌农杆菌介导柱花草炭疽菌遗传转化体系的优化. 热带作物学报, 2013, 34(6): 1007-1012.

[16]易克贤, 黄俊生, 刘国道. 中国柱花草炭疽病原菌遗传多态性的RAPD分析. 微生物学报, 2003, 43(3): 379-387.

[17]高建明, 胡彩平, 郑金龙, 等. 柱花草炭疽病菌T-DNA插入突变体库的构建与分析. 广东农业科学, 2014, 19(10): 142-145.

[20]刘梅, 张玮, 周莹, 等. 葡萄炭疽病研究进展. 中国植保导刊, 2014, 34(1): 29-33.

[27]张超冲, 梁英彩, 蒙绞荣, 等. 柱花草炭疽病菌的鉴定及生物学特性研究. 广西农业大学学报, 1998, 17(1): 87-91.

[28]冯淑芬, 李凤娥, 何朝族, 等. 笔花豆炭疽病菌生物学特性和流行条件研究. 热带作物学报, 1994, 15(1): 90-93.