Ascl2和结肠癌关系的研究进展

刘振民，徐华林，李伶俐，赵 逵

(遵义医学院附属医院 消化内科，贵州 遵义 563099)

综 述

Ascl2和结肠癌关系的研究进展

刘振民，徐华林，李伶俐，赵 逵

(遵义医学院附属医院 消化内科，贵州 遵义 563099)

已有资料显示，Ascl2属于保守的转录因子家族中的一员，含有碱性/螺旋-环-螺旋结构，其在正常组织中的表达仅仅被发现在胎盘滋养层细胞及定位在肠道隐窝基底Lgr5(+)的隐窝基底柱细胞。近几年研究发现，Ascl2与结肠癌的发生、发展、转移及预后密切相关，推测其可作为结肠癌临床诊治的新靶标。本文就Ascl2与结肠癌发生发展的相关研究进展进行综述。

Ascl2；结肠癌；发生发展；诊治

据多年研究发现，Ascl2(Achaete scute-like2 ) 属于保守的转录因子家族中的一员，定位于染色体11p15.5，含有碱性/螺旋-环-螺旋结构，编码的蛋白通过结合E-box元件控制着转录过程[1]，是Wnt信号通路的靶基因之一[2]，与隐窝基底柱细胞( crypt base column cells，CBC细胞)的干性密切相关[3]。其在正常组织的表达仅仅被发现在胎盘滋养层细胞以及定位于肠道隐窝基底Lgr5(+)的隐窝基底柱细胞(CBCs)[2，4]。目前研究认为，结肠癌干细胞可能由CBC细胞演变而来。相关学者指出Ascl2在结肠癌中的表达增强，并且这种增强表达均出现在结肠癌发生、发展过程中的各个阶段；而Ascl2的过度表达导致结肠癌发生肝转移的可能性增加[5-7]。本文就Ascl2与结肠癌发生发展的相关研究进展进行综述。

1 Ascl2与CBC细胞

早在上个世纪80年代末，Johnson JE等从神经嵴衍生的交感神经前体细胞系中分离出与果蝇Achaete scute复合体基因同源的两种不同哺乳动物的Ascl2基因，并指出其主要表达于胚外组织，具有部位特异性[8]。而Ascl2在胚外组织中的表达是由特定的同位母系基因转录的，但仅表达于Lgr5(+)干细胞[9]。之后Jubb AM等运用原位杂交及实时荧光定量技术检测得知Ascl2基因局限表达于大肠、小肠的隐窝基底部及胎盘的滋养层，几乎不表达在其它正常组织中，并且进一步指出其在大肠良恶性肿瘤性疾病中表达增强[2]。van der Flier LG等则进一步报告了Ascl2基因在小鼠肠上皮细胞过表达后，能导致肠隐窝异常增生及其异位隐窝出现。然而，在敲除Ascl2基因的小鼠肠道细胞中发现特定表达的Lgr5+CBC细胞的隐窝干细胞在5天内明显减少甚至消失[4]。更重要的是，作为正常成体肠隐窝干细胞标志物，Lgr5已经被广泛报道。同时， Ziskin等[10]和Barker等[11]则发现结肠癌中Ascl2和Lgr5表达增加，且二者表达呈正相关。根据上述研究发现，我们可以推测Ascl2转录因子在控制CBC细胞“干性”，其异常表达可能参与启动肠道肿瘤的发生。

2 Ascl2与结肠癌

2.1 Ascl2与结肠癌干细胞 在传统的诊治方法中，恶性肿瘤的治疗效果有限，肿瘤转移和复发一直都是个难题。随着肿瘤干细胞理论的横空出世，肿瘤的诊治进入了一个崭新的阶段。该理论指出肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展、转移和复发的根源和“发动机”。在正常情况下，CBC细胞连续分裂和增殖，同时持续迁移至隐窝顶部，以此保证肠道上皮细胞的“新老交替”。与正常的干细胞相类似，肿瘤干细胞也具备多向分化潜力和自我更新能力，并且二者具有相同的表面标志物以及共同的信号调节通路[12]。有关研究发现结肠癌干细胞可能由CBC细胞演变而来。肠上皮细胞的功能和组织结构异常由CBC细胞突变所致，随之内环境的稳定遭到破坏，进而导致了结肠癌发生、发展[13-14]。

早先Cui H等[15]就已指出Ascl2基因位于11p15.5，结直肠癌中这个区域常常发生印迹缺失。据相关研究，survivin和cdc25b在结直肠癌临床中扮演着重要的角色。Survivin是Wnt信号的靶点，可能预示着结直肠恶性肿瘤经放化疗及手术治疗后的有效率[16]。Cdc25b在结直肠癌的表达可以预测总体生存率[2]。Jubb AM等[2]运用qRT-PCR检测出survivin和cdc25b mRNA在用Ascl2 siRNA处理后的HCT-15细胞中表达显著降低；并且研究发现抑制Ascl2在HCT-15和HT-29细胞系中的表达可延长细胞周期中G2期。由此推测Ascl2可能通过调节survivin和cdc25b表达进一步控制G2/M细胞周期的调节点。此后，在该研究团队及相关文献指出Ascl2在结肠癌中的表达增强，并且这种增强表达均出现在结肠癌发生、发展过程中的各个阶段；而Ascl2的过度表达导致结肠癌发生肝转移的可能性增加[5-7]。Ziskin等[20]和Barker等[11]发现结肠癌中Ascl2和Lgr5表达增加，且二者表达呈正相关。朱蓉等利用Ascl2的shRNA干扰质粒转染LS174T细胞，建立稳定转染shRNA-Ascl2/LS174T和shRNA-control/LS174T细胞，采用荧光定量PCR、Transwel1小室侵袭实验等方法观察到干扰后细胞中Ascl2的mRNA和蛋白质表达均显著下调，同时Ascl2干扰后LS174T细胞的侵袭能力明显下降；而用microRNA芯片检测到与上皮细胞-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)有关联的microRNA-200家族在shRNA-Ascl2/LS174T细胞中的表达增强了2倍以上[17]。此后朱蓉等再次利用Ascl2的shRNA干扰质粒转染HT-29细胞，并移植到裸鼠皮下，采用小动物活体成像仪观察发现Ascl2-RNAi抑制HT-29细胞裸鼠移植瘤的生长，证实了Ascl2-RNAi导致结肠癌HT-29细胞体外致瘤能力下降[18]。早前Zhu R等的文献也表明了阻碍Ascl2基因的表达能显著降低结肠癌HT-29细胞在体内外的成瘤能力，并且可能由miR-302b途径阻滞结肠癌干细胞的生长进而抑制了结肠癌的发生发展；同时HT-29细胞中的 相关“干性”标记物(如CD133、Sox2、Lgr5、C-myc、Oct4等)的表达相应减少[19]。上述种种证据均表明Ascl2可作为结肠癌的肿瘤标志物及判断其预后，与结肠癌干细胞密切相关。

2.2 Ascl2与结肠癌分化 同源异型框转录因子-2 (caudal-relatedhomeodomaintranscriptionfactor2，CDX2)是一种新发现的核转录因子，对肠粘膜上皮的维持和发育是必不可少的，同时抑制小肠粘膜上皮细胞和结直肠癌细胞的生长和分化[20-22]。有关研究发现其特异性的表达于消化道上皮细胞中，呈梯度变化表达于人类十二指肠以下的肠道中，而在上消化道上皮细胞中几乎不表达[23]。Verzi MP等[24]认为CDX2维持肠道干细胞的同一性，对肠道肿瘤产生抑制作用。粘蛋白2(Mucin2，MUC2)主要是由肠道粘膜(绝大多数位于十二指肠和结肠)杯状细胞分泌的一种高分子量富含寡糖链的分泌型粘蛋白；肠三叶因子(Trefoil Factor Family3，TFF3)是主要由小肠和结肠杯状细胞分泌的一种分泌型短肽，二者皆为杯状细胞所特有，因此可作为杯状细胞特异性的表面标志物[25-26]。

早先Umar S已指出CDX2可特异性的结合MUC2基因启动子，促进其向杯状细胞的表型分化[27]。此后李晓桓等利用QT-PCR检测出Ascl2表达受到干扰后，MUC2和TFF3 mRNA在结肠癌细胞系中的表达明显增强；而采用Western blot方法同样观察到阻碍Ascl2的表达，MUC2 mRNA明显增强表达于结肠癌细胞系中[28]。而Yangyang Shang等研究发现在结肠癌细胞系中，干扰Ascl2的表达会显著增加肠道特异性标志物MUC2和肠特定同源基因CDX2的表达，并揭示了Ascl2的表达与MUC2和CDX2呈负相关[29-30]。由此可知Ascl2与结肠癌分化相关，并且Ascl2的表达抑制会导致结肠上皮细胞的表型向杯状细胞转化。为了进一步探讨Ascl2对结肠癌上皮细胞中CDX2基因的转录调控作用，Yangyang Shang等进行了后续的相关研究，其采用双荧光素酶活性实验和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验证实了Ascl2在结肠癌上皮细胞中可能直接结合CDX2近端启动子而抑制CDX2基因表达[29]。以上研究揭示了Ascl2可能通过CDX2参与了结肠癌的细胞分化过程，为研究结肠癌的防治提供了新的思路和靶点。

2.3 Ascl2与EMT 上皮细胞-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去了与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表象，在胚胎发育、组织重建、慢性炎症、肿瘤的进展和转移及多种纤维化疾病中发挥了重要作用[31-32]。miRNA-200家族的成员包含miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-141和miR-429，属于肿瘤抑制基因，其表达在侵袭性肿瘤中减少，同时它们可抑制肿瘤细胞侵袭和转移、粘附、迁移及EMT过程的发生[33-35]。有关研究证实了miRNA-200家族通过ZEB1/ ZEB2参与调节EMT的转录调控过程[7，17，19,36-37]。Yin Tian等[32]则通过细胞克隆形成实验、MTT实验、划痕实验和Transwell实验及基因芯片检测等方法揭示了Ascl2干扰后可导致结肠癌细胞生长抑制，促进了结肠癌细胞EMT-MET的发生发展，并对miRNA-200家族调节EMT的重要调节蛋白ZEB1/ ZEB2进行实验检测，进一步指出Ascl2干扰引起的结肠癌EMT-MET逆转过程是miRNA-200家族先调控ZEB1/ ZEB2，进而调节结肠癌EMT过程而最终完成的。而且，该团队在后续的实验中进行了荧光素报告基因实验和miRNA-inhibitors转染实验，并发现了Ascl2调节结肠癌EMT过程的机制是通过作用于miR-200族的两条调控轴而实现的，即miR-200a-200b-429轴和miR-200c-141轴。上述的各种研究结果初步揭示了Ascl2参与EMT过程的调控机制，进而有利于研究结肠癌的发病机制，为诊治结肠癌提供了新的靶点和方向。

2.4 Ascl2与Wnt信号通路 经典Wnt信号通路对于肠上皮干细胞的维持、分化及增殖过程中发挥着至关重要的作用。Klaus A等指出Wnt配体可与细胞表面的跨膜受体结合，诱导原本位于胞质中的β-catenin活化并进入胞核，与Wnt靶基因TCF-4结合成复合体，通过激活下游靶基因的转录，进而促进了结肠癌的生长[38]。Wnt信号与肠隐窝的维持及结肠癌密切相关，如通过β-catenin或TCF-4的基因缺失、Wnt抑制剂Dkk1的过表达及药物的抑制作用诱导肠隐窝缺失等方式抑制Wnt信号，从而参与了该过程[38-39]。而Ascl2已被证实了是Wnt信号通路的靶基因之一。Schuijers J等[40]报道Ascl2可形成一个自动激活的循环，该循环可使其处于一种独特的“开/关”表达状态，同时Wnt/R-spondin可激活循环。在循环中Ascl2扮演着正反馈的自动激活的角色，而Wnt梯度决定了“开/关”状态。Antonis Giakountis等[3]进一步指出在结肠癌中，Wnt不是直接由Ascl2调控的，而是由相邻的WiNTRLINC1(一种长链非编码RNA)与TCF4/b-catenin通过拓扑回路调控Ascl2，最终调控Wnt信号通路。种种迹象表明Ascl2参与了Wnt信号通路，但具体机制有待进一步研究。

3 Ascl2与结肠癌的诊治

美国癌症数据显示结肠癌发病率居全球第三，其死亡率却位居全球第二[41]。结肠癌的发病率和死亡率逐年升高，且越来越年轻化，但其发病机制尚未完全明确，目前认为是一个涉及多因素的疾病，包括生活方式、饮食习惯和遗传等。传统的诊治方法中，大多数患者得到确诊及相应治疗时，肿瘤已被证实发生了侵袭和远处转移，不能得到治愈。随着肿瘤干细胞理论的提出及近年来结直肠癌中肿瘤干细胞被证实存在[42]，寻求特异性结肠癌肿瘤标志基因和特异性的靶向基因治疗为结肠癌患者的早期诊断和治疗带来新希望。前文已指出，经过多方研究，Ascl2表达仅限于正常组织中的胎盘以及位于肠道隐窝基底的Lgr5+CBC细胞，并且这种增强表达均出现在结肠癌发生、发展过程中的各个阶段；而Ascl2的过度表达导致结肠癌发生肝转移的可能性增加，促进了结肠癌发生发展，并且可能通过CDX2、EMT、Wnt信号通路等参与该过程。种种迹象表明Ascl2可能作为一种用于结肠癌早期诊断、预后及是否转移的新型肿瘤标志物，为研究结肠肿瘤的发病机制及其防治提供了新的思路和靶点！但需要更多的前瞻性资料加以验证及深入研究。

4 展望

目前，对Ascl2的研究已经进入一个新的阶段，Ascl2已被证实参与了结肠癌的增殖、凋亡、侵袭和转移等过程，其可能作为用于结肠癌早期诊断、预后及转移的一种新型肿瘤标志物。然而，仍有众多科学问题有待解决，如前文指出Ascl2可能与结肠癌分化相关，但目前只从结肠癌细胞系中研究，而未能针对原代干细胞进行研究。又如，Ascl2参与Wnt信号通路的具体调控机制及二者之间的反馈调控如何？再如，目前研究出的调控机制多经动物实验所得，且多数停留在细胞水平，其在结肠癌患者体内是否一致？还有，如何开发靶点为Ascl2的结肠癌临床生物治疗策略？Ascl2是否参与结肠癌的耐药机制？如何合理制造出具有高效抑制Ascl2作用的生物制剂等。总之，这些科学问题的深入探索，不仅有利于Ascl2与结肠癌关系的阐明，且对于相关临床诊断、治疗新靶标和策略发展均具有积极意义。

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收稿2016-10-17;修回2016-11-21〗

(编辑：谭秀荣)

Progress in research on relationship between Ascl2 and colorectal cancer

LiuZhenmin，XuHualin，LiLinli，ZhaoKui

(Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

Current literatures have shown that Ascl2(Achaete scute-like2 ) is a member of the conservative family of transcription factors and contains a basic helix-loop helix domain.Its expression in normal tissue cells is limited to the trophoblast cells; placental trophoblastic cells and the Lgr5 positive crypt basement column cells (CBCs).It is localized in the small intestine and large intestine crypt basement.Recent studies have reported that Ascl2 is closely related to the occurrence,growth,metastasis and prognosis of colon cancer.It suggests that Ascl2 might be used as a new target of clinical diagnosis and treatment of colon cancer.The related research progress in the relationship between Ascl2 and colon cancer is reviewed in this paper.

Ascl2；colon cancer；development；diagnosis and therapy

国家自然科学基金资助项目(NO：81560467)；贵州省高层次人才科研条件特助基金资助项目(NO：TZIF 201132)。

赵逵，男，教授，硕士生导师，研究方向：干细胞与结肠癌，E-mail:Kuizhao95868@ MSN.com。

R735

A

1000-2715(2016)06-656-05