COM.TEC型血细胞分离机采集外周血单个核细胞效果分析

范振海,章 涛,余丽梅,魏在荣,彭笳宸,任明强,方 宁

(遵义医学院附属医院，1.贵州省细胞工程重点实验室；2.烧伤整形外科；3.骨科；4.血液科；贵州 遵义 563099)

技术与方法

COM.TEC型血细胞分离机采集外周血单个核细胞效果分析

范振海1,章 涛1,余丽梅1,魏在荣2,彭笳宸3,任明强4,方 宁1

(遵义医学院附属医院，1.贵州省细胞工程重点实验室；2.烧伤整形外科；3.骨科；4.血液科；贵州 遵义 563099)

目的 观察费森尤斯COM.TEC型血细胞分离机autoMNC程序采集患者外周血单个核细胞的效果。方法 粒细胞集落刺激因子动员后，采用COM.TEC型血细胞分离机autoMNC程序采集患者外周血单个核细胞，流式细胞仪检测CD34+细胞和单个核细胞百分比，血常规检测白细胞计数。对外周血单个核细胞采集效率与单个核细胞采集参数及采集物质量指标进行相关性分析。结果 28例患者平均处理血量2.34±1.75 L，采集物体积46.63±28.17 mL，白细胞计数(11.40±10.40)×1010个细胞/L，单个核细胞百分比(83.79%±21.77) %，CD34+细胞百分比(0.81±1.54) %。MNCs采集效率与外周血处理血量呈正相关(rs=0.538,P<0.05)，和采集前外周血MNCs计数呈负相关(rs=-0.379.P<0.05);MNCs采集效率与采集物白细胞和单个核细胞总数呈正相关(rs=0.866，rs=0.924，P<0.05)，与采集前外周血白细胞计数、采集物CD34+细胞和单个核细胞百分比之间无相关性(P>0.05)。结论 外周血单个核细胞采集效率作为评价COM.TEC型血细胞分离机autoMNC程序采集效果的指标，可综合反应重要的采集参数与采集物质量。

血细胞分离机；外周血；单个核细胞；CD34+细胞

经粒细胞集落刺激因子动员，可显著提高外周血中造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSCs)和间充质干细胞的含量，通过血细胞分离机采集外周血单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)可初步富集外周血干细胞，用于恶性血液病大剂量化疗后，促进患者造血免疫功能恢复，或将富集的外周血干细胞用于糖尿病足等疾病治疗[1-2]，促进组织损伤修复，取得了明显疗效。与骨髓干细胞采集相比，血细胞分离机富集外周血干细胞具有自动化集成度高、无需麻醉、安全、无痛苦及自体粒细胞和血小板恢复快等优势。

外周血MNCs采集过程中，尽管所用厂家与机型不同，细胞自动化采集水平不相上下，但能否合理使用与科学设置采集参数，最终对采集物质量会造成明显影响，一定程度上决定着自体外周血干细胞移植治疗效果[3-5]。COM.TEC是德国Fresenius Kabi公司推出的血细胞分离机，国内外都是一款外周血MNCs采集、分离和HSCs富集的主流机型。本文重点分析了COM.TEC型血细胞分离机autoMNC程序的外周血MNCs的采集效率(collection efficiency,CE)与白细胞(white blood cell，WBC)计数、MNCs计数等主要采集参数和采集物质量指标之间的相关性，为采集实施过程中合理设置参数，科学评价外周血MNCs采集物质量提供重要依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2008年12月至2011年04月在我院进行外周血MNCs采集的患者28例，年龄21～72岁，平均41岁，男性19例，女性9例，急性髓系白血病2例，急性淋巴细胞白血病1例，血栓闭塞性脉管炎5例，糖尿病足1例，股骨头坏死5例，骨折不愈合14例。采集前患者皮下注射粒细胞集落刺激因子5 μg/kg/d，动员期间监测外周血WBC计数，动员3 d WBC计数>20×109个细胞/L后，行外周血MNCs采集。

1.2 仪器 德国Fresenius Kabi公司生产的COM.TEC型血细胞分离机，FACS Calibur流式细胞仪和ProCOUNTCD34+细胞计数试剂盒均为美国BD公司产品。

1.3 方法 采集前行血常规检测，采用autoMNC程序，依据患者身高、体重、红细胞压积、WBC、血小板计数、外周血MNCs计数等设置参数，程序将根据输入资料自动预测CD34+细胞采集数，也可根据患者自身情况稍作调整，处理血量1.24～8.96 L，平均2.34 L，抗凝剂枸橼酸葡萄糖与全血的比例设置1∶9～1∶11。

1.4 采集物处理 采集物终体积因不同疾病治疗需要设置在26～123 mL，平均体积为46 mL，并将采集物行血常规检查，CD34+细胞百分比及MNCs百分比分别采用绝对计数微球与CD45+CD34+细胞计数、CD45+细胞标记，经FACS Calibur流式细胞仪检测、分析获得。

1.5 MNCs采集效率计算[6-7]MNCs-CE的计算公式：MNCs的CE=(采集物MNCs总数×100)÷(采集前外周血MNCs计数×总循环血量)，采集前外周血MNCs计数=采前外周血WBC计数×采前外周血MNCs百分比；采集前外周血MNCs百分比=外周血淋巴细胞百分比+外周血单核细胞百分比，采集物MNCs总数=采集物WBC计数×采集物MNCs百分比×采集物体积，采集物中CD34+细胞总数=采集物WBC计数×采集物CD34+细胞百分率×采集物体积。

2 结果

2.1 采集参数和外周血MNCs的CE MNCs的CE是评价外周血HSCs采集质量的重要指标，由MNCs的CE计算公式可知，采集物中MNCs总数越高，MNCs的CE越高，而采集前外周血MNCs计数和总循环血量越高，则MNCs的CE越低。 根据COM.TEC血细胞分离机采集参数(见表1)与采集物中重要细胞数量和比例检测(见表2)，按照上述公式计算，采集物MNCs总数为(4.62±7.78)×109个细胞，MNCs的CE为(44.13±80.61)%。

2.2 采集物MNCs和CD34+细胞总数 采集物中CD45+细胞为MNCs的标志，CD45+细胞中CD34+细胞则是公认的HSCs表面标志，CD34+细胞含量的高低与CD34+细胞总数决定着采集物质量的好坏和自体外周血干细胞移植的疗效。根据公式计算，采集物CD34+细胞总数(5.26±11.8)×107个细胞。其中恶性血液病患者采集物中MNCs总数为(2.08±1.77)×1010个细胞，CD34+细胞总数(3.73±1.00)×108个细胞，每例患者所采CD34+细胞总数均大于2×106个细胞/kg，显著高于HSCs移植的基本质量要求。

供者血容量(L)处理血量(L)采集前外周血WBC计数(1010个细胞/L)红细胞压积(%)MNCs计数(×109个细胞/L)MNCs百分比(%)398±060234±175264±0963768±594367±2221375±005

指标采集物体积(mL)4663±2817WBC计数(1010个细胞/L)1140±1040红细胞(1012个细胞/L)087±052MNCs(%)8379±2177CD34+细胞(%)083±154

2.3 外周血MNCs的CE与采集参数的相关性分析 MNCs的CE和采集前外周血MNCs计数呈非线性负相关，Spearmen’s相关系数(rs)=-0.379(P<0.05)，而与外周血处理血量呈正相关，相关系数rs=0.538(P<0.05，见图1)。但与采集前外周血WBC计数和MNCs百分比无明显相关性(P>0.05)。

图1 外周血MNCs的CE与采集物关键指标的相关性分析。

2.4 外周血MNCs的CE与采集物质量指标的相关性分析 外周血MNCs的CE与采集物WBC和MNCs总数呈正相关，rs分别为0.866和0.924(P<0.05)，而与采集物中CD34+细胞总数、CD34+细胞百分比和MNCs百分比无明显相关性(P>0.05，见图2)。

图2 外周血MNCs的CE与采集物质量指标的相关性分析

2.5 外周血MNCs采集中的不良反应 28例患者采集过程中有9人出现轻度口唇或手足麻木的低血钙症状，该不良反应发生率为32.14%，给予口服或缓慢静脉推注10%葡萄糖酸钙对症处理后症状消失，未见其它明显不良反应。

3 讨论

自体外周血干细胞移植已逐渐成为常用的临床治疗技术[8]，但外周血干细胞含量很少，约占MNCs的0.01%～0.1%，相当于骨髓干细胞含量的1%～10%，因此能否采集、富集到足够的外周血干细胞是移植治疗成功的前提和关键[9]。

除安全、有效的干细胞动员剂使用外，血细胞分离机的合理使用对干细胞的采集能力是保障短时间高效率获取HSCs的重要因素之一。尽管目前临床上常以计算CD34+HSCs采集量占流经血细胞分离机的CD34+细胞总数的比例来进行HSCs采集效果的评价，CD34+细胞总数则由采集前CD34+细胞的比例与总循环血量的乘积表示[6,10-11]。采集的外周血MNCs中，富集了CD34+的HSCs，因此采集物中MNCs总数很大程度上影响了CD34+细胞总数，而采集物中的WBC计数则是决定采集物中MNCs总数的关键因素。

尽管因所用血细胞分离机厂家、型号存在差异，外周血MNCs或HSCs采集性能也不尽相同[12-15]，但CE仍是常用的外周血细胞采集效果的重要评价指标。与文献报道的其他型号血细胞分离机相比[16-17]，本研究所选COM.TEC血细胞分离机autoMNC程序采集外周血MNCs的采集参数及采集物质量指标的结果来看，在采集前外周血的一定WBC计数和MNCs计数范围内，采集所需处理血量较少，采集物体积也较小，而采集物中WBC计数、MNCs百分比、CD34+细胞百分比及CD34+细胞总数均较高，不但可以满足研究所涉及病种对自体干细胞移植所需的要求，且外周血MNCs的CE也较高。

进一步分析外周血MNCs的CE与采集参数及采集物质量指标的相关性，结果显示，外周血MNCs的CE与采集前外周血MNCs计数呈负相关，与文献报道一致[4,18]，即血细胞分离机梯度离心过程中，外周血MNCs所形成的白膜层是主要采集目标，当外周血MNCs过高时，白膜层过厚，可导致采集不完全，而降低CE，这可能是在影响外周血MNCs的CE因素中，COM.TEC血细胞分离机与Cobe Spectra、Fenwal CS 3000 Plus血细胞分离机明显的不同[2]。但外周血MNCs的CE与处理血量成正相关，因此采集时，应根据外周血MNCs计数，即采集前外周血WBC计数、外周血淋巴细胞百分比和单核细胞百分比，适当调整每循环周期白膜采集体积的大小，从而提高CE。此外，本研究结果还发现外周血MNCs的CE与采集物WBC计数和MNCs总数呈正相关，而与采集物的CD34+细胞总数、CD34+细胞百分比和MNCs百分比无明显相关性，表明采集物WBC计数、MNCs总数是评价采集物质量和采集CE的重要指标，而不能只是简单地以采集物中MNCs和CD34+细胞百分比来进行判断。反之，根据临床疾病治疗对CD34+HSCs数量的需要，也可根据采集前外周血WBC计数、MNCs计数及淋巴细胞和单核细胞百分比推算需处理血量及每循环中白膜采集体积。由此可见，外周血MNCs的CE作为COM.TEC血细胞分离机autoMNC程序采集MNCs的评价指标，不但受采集前多个采集参数的影响，即可通过提高处理血量和采集前有效的升高患者外周血WBC数，及调整适宜的白膜采集体积来提高CE，也能很好地提高采集物质量。外周血MNCs的CE与采集物MNCs总数的正相关，也提示CE的上述影响因素及有关采集参数的调整，可能对免疫细胞治疗中的外周血MNCs采集也具有重要指导意义。

此外，需引起注意的是外周血MNCs采集中抗凝剂枸橼酸盐与血液中钙离子螯合，可引起口唇或手足麻木等低血钙症状[19]，这一较高的不良反应发生率仍需采取积极措施，在不影响外周血MNC的CE基础上，适当减低抗凝剂枸橼酸葡萄糖的用量和比例，不失为一种可以考虑的防治策略。

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收稿2016-09-10;修回2016-11-12〗

(编辑：谭秀荣)

Efficiency of collecting peripheral blood mononuclear cells by COM.TEC blood cell separator

FanZhenhai1,ZhangTao1,YuLimei1,WeiZairong2,PengJiachen3,RenMingqiang4,FangNing1

(1.Key Laboratory of Cell Engineering in Guizhou Province; 2.Department of Burn and Plastic Surgery; 3.Department of Orthopaedics; 4.Hematology department;Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To observe the efficiency of Fresenius COM.TEC blood cell separator autoMNC program on collection of peripheral blood mononuclear cells (MNCs).Methods After mobilization with granulocyte colony-stimulating factor,the peripheral blood MNCs were collected by autoMNC program of Fresenius COM.TEC blood cell separator.The percentage of MNCs and CD34+cells were detected by flow cytometry.The white blood cells (WBC) were counted by blood routine.The correlation analysis were performed between collection efficiency (CE) of MNCs and the count of MNCs and WBC in peripheral blood,total WBC,the percentage of MNCs and CD34+cells in collection.Results The processed mean blood volumes were 2.34 ± 1.75 L in 28 patients.Collection volume was 46.63 ± 28.17 ml.The count of WBC was (11.40±10.40) ×1010cells/L in collection.The percentage of MNCs and CD34+cell were (83.79±21.77)% and (0.81±1.54)% in collection,respectively.There was a positive correlation between the CE of MNCs and prcessed blood volume (rs=0.538,P<0.05).ButanegativecorrelationbetweentheCEofMNCsandthecountofMNCsinperipheralbloodbeforecollection(rs=-0.379,P<0.05).A positive correlation between the CE of MNCs and the count of WBC and MNCs in collection (rswas 0.866 and 0.924,P<0.05).TherewerenocorrelationsbetweentheCEofMNCsandcountofWBCinperipheralbloodbeforecollection,percentageofCD34+cellsandMNCsincollection(P>0.05).Conclusion Collection efficacy of peripheral blood MNCs using COM.TE blood cell separator autoMNC program could reflect the important collection parameters and the quality of the collection.

blood cell separator; peripheral blood; mononuclear cell; CD34+cell

贵州省省长资金临床应用课题专项(NO：黔省专合字[2012]107)；贵州省科技厅资助项目(NO：黔科合J字[2010]2182)。

余丽梅，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：药理学，E-mail:ylm720@sina.com。

R457.2

A

1000-2715(2016)06-0627-04