泌尿生殖道支原体感染的优化检测方案研究

吴　磊，　周运恒，　陈向明，　王国江，　刘　瑛，　陈　峰，　冯　景，唐群力，　汪瑞忠，　房　华，　赵　虎，　方　毅，　周春妹，　黄声雷，　唐振华，陆庭嫣，　汤　瑾0，　王坚镪0，　韩立中，　肖淑珍，　胡伟忠，　杨　阳，　顾伟鸣

(1.海市皮肤病医院检验科，上海 200443；2.武警上海市总队医院检验科，上海 201103；3.上海市嘉定区南翔医院性病科，上海 201802；4.上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092；5.上海市奉贤区中心医院检验科，上海 201499；6.浦东新区人民医院检验科，上海 201299； 7.复旦大学附属华东医院检验科，上海 200040；8.复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032；9.上海交通大学医学院附属中国福利会国际和平妇幼保健院检验科，上海 200030;10.上海交通大学附属第六人民医院检验科，上海 200233；

11.上海交通大学医学院附属瑞金医院临床微生物科，上海 200025)



泌尿生殖道支原体感染的优化检测方案研究

吴磊1，周运恒2，陈向明3，王国江3，刘瑛4，陈峰4，冯景5，唐群力5，汪瑞忠6，房华6，赵虎7，方毅7，周春妹8，黄声雷8，唐振华9，陆庭嫣9，汤瑾10，王坚镪10，韩立中11，肖淑珍11，胡伟忠1，杨阳1，顾伟鸣1

(1.海市皮肤病医院检验科，上海 200443；2.武警上海市总队医院检验科，上海 201103；3.上海市嘉定区南翔医院性病科，上海 201802；4.上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092；5.上海市奉贤区中心医院检验科，上海 201499；6.浦东新区人民医院检验科，上海 201299； 7.复旦大学附属华东医院检验科，上海 200040；8.复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032；9.上海交通大学医学院附属中国福利会国际和平妇幼保健院检验科，上海 200030;10.上海交通大学附属第六人民医院检验科，上海 200233；

11.上海交通大学医学院附属瑞金医院临床微生物科，上海 200025)

摘要：目的通过优化支原体培养的方法和流程建立新的检查方案，提高检测解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)感染的准确性。方法优化支原体固体和液体组合培养的检测模式，制定了一套可操作性的标准化实验方案，遴选11家二级以上医疗机构，对随机入选病例的泌尿生殖道分泌物样本开展联合研究。相关的实验数据进行统计分析，评价临床应用前景。结果747例样本总体阳性率45.1%(337/747)，其中Uu阳性率41.1%(307/747)，Mh阳性率13.9%(104/747)。Uu和Mh原始样本接种的阳性符合率分别为92.6%和94.0%(P均<0.01)。Uu和Mh转种后的阳性符合率分别为97.5%和96.1%(P均>0.05)。液体培养变色后转种提高了固体培养的敏感性。有17例液体培养阳性的样本经过原代和转种2次固体培养，均没有观察到菌落。固体培养降低了液体培养的假阳性。固体培养与液体培养同时接种样本，明显缩短了固体培养的检测周期。超过85%的支原体在24 h以内观察到菌落，而48 h以内固体培养与液体培养的阳性率几乎没有差别。结论以固体和液体组合培养的检测模式，尽管增加了检验成本，但对泌尿生殖道支原体感染的检测具有更高的敏感性和特异性，新检测方案可以在临床推广应用。

关键词：支原体；解脲脲原体；人型支原体；培养；检测方法；标准化

支原体是一种能在无生命培养基上繁殖的最小原核细胞型微生物[1]。解脲脲原体(ureaplasma urealyticum，Uu)和人型支原体(mycoplasma hominis，Mh)是引起泌尿生殖道感染的常见病原体[1-3]，可以在性伴之间传播，孕妇通过产道传染给后代[1,3]。

全国医院普遍开展Uu和Mh的常规检测，几乎均采用液体培养方法[4-6]。其检测原理基于Uu和Mh分别利用液体培养基中的尿素和精氨酸，分解后产氨和二氧化碳，含酚红指示剂的培养液随着pH值升高而由黄色变红色，据此来判断是否有支原体生长[1，7]。实际上，这是利用微生物生物化学反应来达到检测目的。这种检测方法和程序违反微生物生化实验的基本原则：必须分纯菌株。泌尿生殖道内含有多种定植微生物，呈优势生长的条件致病菌或分泌物由于受外用药物污染等因素影响，样本接种到液体培养基内会导致pH值增高或降低，前者造成假阳性，后者造成假阴性。当单独使用Uu-Mh混合液体培养基，无法仅通过液体培养瓶的颜色变化来分辨Uu和Mh。当将液化的精液样本直接加入液体培养瓶，可立刻看到颜色变红。另外，液体培养方法微孔鉴定药物敏感性的结果存在较大争议：当Uu和Mh合并感染时，无法区分是哪种支原体的药物敏感性结果。

经典的固体培养法通过低倍显微镜直接观察到支原体形态，是实验诊断的金标准方法。但是固体培养也存在检测周期长、不宜观察结果等因素[5]，国内仅少数实验室开展检测[4-6]。实验方法学研究发现，虽然固体培养法特异性较高，一些操作技术和检测流程等原因也可降低敏感性[5]。单独进行固体或液体培养的缺陷问题已成为影响检测质量的重要因素。

本研究旨在通过固体和液体的组合培养观察Uu和Mh的生长规律，评估联合培养在检测中的价值，改善泌尿生殖道Uu和Mh感染的实验室检测方法和流程，同时对优化方案进行应用性推广研究。

材料和方法

一、参与机构

上海市二级及以上地方和部队的11家医院：上海市皮肤病医院、武警上海市总队医院、上海市嘉定区南翔医院、上海交通大学医学院附属新华医院、上海市奉贤区中心医院、浦东新区人民医院、复旦大学附属华东医院、复旦大学附属中山医院、上海交通大学医学院附属中国福利会国际和平妇幼保健院、上海交通大学附属第六人民医院和上海交通大学医学院附属瑞金医院联合参与研究，各医院均参加了历年上海市支原体培养的室间质评，成绩均为优秀。本研究按照固体和液体组合培养的实验方法和检测程序，对泌尿生殖道分泌物样本进行支原体检测。

二、研究对象和排除标准

选择2015年7至8月在11家医院性病门诊和不孕不育门诊的就诊者为研究对象，排除无性行为能力的人群，采样前2周内无抗菌药物使用史，女性在非怀孕和月经期。

三、检测试剂

众爱生河北生物科技有限公司生产的Uu和Mh选择分离培养、鉴定、药物敏感性试剂盒(冀食药监械2012第2400018号，批号1506103)。Uu和Mh的选择分离培养固体培养基(冀邢食药监械2013第1400002号，批号1506205)。

四、方法

1. 样本采集男性采集尿道分泌物样本，采集样本前2 h禁尿，用尿道专用无菌棉拭子伸入男性尿道口2 cm，轻轻转动并停留30 s后取出备用。女性采集宫颈分泌物样本，先用无菌拭子擦去宫颈口外溢的黏液后，用1根新的女性采样拭子插入宫颈口1~2 cm，轻轻转动并停留30 s后取出备用。

2. 样本接种(1)原始样本的固体培养基接种：拭子顶端轻轻地在固体培养基表面按照曲线方式进行划种。(2)转种样本的固体培养基接种：从刚刚变色液体培养基中吸取约10 μL，滴种在固体培养基上。(3)原始样本的液体培养基接种：将刚刚划种固体培养基的拭子投入液体培养基中，充分搅拌20 s，静置15 min后，按照说明书接种到微孔鉴定板，再滴加液状石蜡油。

3. 培养条件使用 CO2培养箱进行培养，培养温度(36±1 ℃)，培养箱底部有水盒保持湿度。待固体培养基表面无液体流动后翻转接种面，随液体培养基同时放入培养箱。

4. 观察和处理接种样本后，从次日起每天8∶30和16∶00 2次观察培养情况，每次观察结果都在实验记录表中逐项填写记录，至72 h，避免滞后生长菌株漏检。首先观察液体/微孔板/固体培养后颜色是否改变；其次观察液体/微孔板培养的浊度和沉淀状态；最后用10倍物镜观察固体培养基上菌落，沿着划种/滴种痕迹至少连续观察5个视野。当液体瓶/微孔板培养物发生变色，固体培养基中没有菌落生长和/或颜色改变，立即取10 μL液体培养物转种1块新的固体培养基。

5. 结果判断以固体培养基菌落生长特征为主要诊断依据，参考液体/微孔板培养颜色变化，给出Uu和/或Mh生长报告。显微镜下观察到典型菌落：棕褐色颗粒/褐色海胆样菌落为Uu；煎蛋样菌落为Mh。培养液体由黄色变为红色且澄清透明者为疑似支原体阳性。

6. 质量控制所有参与研究的人员进行实验操作和数据记录的培训，并且共同探讨和决定最终的可行性研究方案。

五、统计学方法

患者信息及实验记录输入Excel表，导入SPSS 16.0软件进行统计分析，采用配对χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、 一般情况

共计入选病例747例，年龄17~72岁(平均33岁)。其中男305例，女442例(男女比为1∶1.45)。

二、总体检出情况

按照研究方案确定的判断标准，固体培养支原体总体阳性率45.1%(337/747)，其中Uu阳性率41.1%(307/747)，Mh阳性率13.9%(104/747)。液体培养瓶和微孔鉴定板颜色改变疑似阳性率45.7%(342/747)，其中Uu疑似阳性率42.2%(315/747)，Mh疑似阳性率15.0%(112/747)，Uu+Mh疑似阳性率11.5%(86/747)。

三、固体培养与液体培养检测比较

按照研究方案遇到固体未见菌落生长而液体培养发生颜色改变的情况，需要将液体及时转种1块新的固体培养基。固体培养与液体培养原始样本接种Uu和Mh阳性符合率分别为92.6%和94.0%，二者差异有统计学意义(χ2=43.65、13.89，P均<0.01)。固体培养与液体培养Uu和Mh转种后的阳性符合率分别为97.5%和96.1%，二者差异无统计学意义(χ2=1.89、1.24，P均>0.05)。

四、固体培养基、液体瓶和液体微孔鉴定板检测的结果比较

检测发现共有22例样本液体瓶发生颜色改变，而微孔鉴定板没有发生颜色变化，其中有17例(男4例，女13例)样本固体培养未见菌落，5例样本在转种固体培养后看到菌落，2例在原始固体培养和转种固体培养看到菌落。见表1。培养现象见图1~图3。

表1　固体培养基、液体瓶和液体微孔鉴定板检测不一致结果

注：(a)为阴性对照；(b)为观察到Uu、Mh菌落的固体培养；(c)为液体瓶疑似阳性(培养时间短，刚刚变色)；(d)为微孔鉴定板条

图1固体和液体培养24 h的外观

注：(a)为阴性对照；(b)为观察到Uu、Mh菌落的固体培养；(c)为液体瓶疑似阳性(培养时间长，变色变深)；(d)为微孔鉴定板条

图2固体和液体培养48 h的外观

五、支原体检测周期

按照研究方案所有检测应观察至72 h。固体培养生长菌落的样本中，在24 h以内生长的Uu和Mh分别是93.1%和85.4%，在24~48 h生长的分别是6.9%和12.5%，在48 h后生长的分别是0.0%和2.0%。液体培养的样本中，在24 h以内发生颜色改变的Uu和Mh分别是97.9%和93.8%，在24~48 h变色的分别是21.4%和5.3%，在48 h后生长的分别是0.6%和0.9%。

注：10倍物镜下Uu和Mh观察结果；固体琼脂从浅黄色变成浅红色提示有支原体生长，背景有杂质提示是原始样本接种

图3原始样本接种固体培养基显微镜下结果

讨论

泌尿生殖道支原体感染的常规检测存在不够完善的问题[4-8]。我们依靠上海市性病检测质量控制的管理平台，经过长期的生物学和方法学的比较研究，汇聚专家意见后制定了泌尿生殖道支原体感染的常规检测标准化方案，在11家二级以上医院进行应用性研究。该方案的主要特点：(1)检测方法是液体和固体联合的模式；(2)固体培养观察到菌落作为主要诊断依据，液体培养颜色改变和浊度情况作为辅助参考依据；(3)检测程序是样本同步接种固体和液体培养基，当液体培养变色而固体未见菌落时，取液体培养物转种固体培养基；(4)由于转种时不需要过滤，减少了操作环节和降低了成本。新方案的优势在于液体培养在抑制杂菌的同时也支持支原体增殖，提高了检测敏感性，降低杂菌污染，转种固体培养基显示背景杂质少，菌落清晰。固体培养可以通过观察典型菌落形态而提高特异性。另外，固体培养可以识别菌落形态的多态性，通过获得分纯菌株开展后续研究，加深理解支原体感染与疾病的相互关系。

用固体和液体组合方法针对性病和不孕不育门诊高危感染人群的检测，Uu和Mh总感染率分

别是41.1%和13.9%。固体培养与液体培养同步接种样本，明显缩短了固体培养的检测周期。本研究用固体培养时，超过85%的支原体在24 h以内观察到菌落，仅比液体培养低了约8%比例，而48 h以内固体培养与液体培养的阳性率几乎没有差别，见图1和图2。

固体培养与液体培养组合检测提高了检测的准确性。液体培养颜色改变可以通过固体培养基表面观察典型菌落而得到确证。大部分原始接种样本，Uu和Mh的固体与液体培养同时出现了阳性，但是固体培养敏感性较低，导致与液体培养阳性率差异有统计学意义。鉴于高pH值的培养液不利于支原体存活，我们研究方案中强调了液体颜色改变后必须立刻转种的要求。将液体培养转种后，固体与液体培养的阳性率差异无统计学意义，说明液体培养变色后转种固体可以提高检测的敏感性。有报道液体培养有较高的假阳性率[6]，本研究结果显示有17例样本液体培养疑似阳性结果，在经过原代和转种2次固体培养，均没有观察到菌落。这个结果有2种提示：固体培养可以降低液体培养假阳性的发生；单独使用液体瓶进行检测会有更高的假阳性。

培养基的质量会影响检测结果。在中国食品和药品管理局网站上查询到仅有几家符合商品化要求的同一体系固体和液体组合的培养基产品。从预先实验阶段的比对数据看，采用Uu (ATCC 27813)和 Mh (ATCC 23114)做质控，该产品与法国梅里埃的配套固体和液体组合培养基的检测性能基本一致。该国产商品培养基还有2个特性：固体培养会改变颜色提示有支原体生长，见图3。液体培养变色时间较梅里埃公司产品延缓8 h，恰好给液体培养的支原体赢得了更长的存活时间，提高了转种固体培养的阳性率。另外，该固体培养基试剂盒还提供CO2化学发生片，给基层医院开展检测提供了方便。固体和液体组合培养的模式会增加直接成本，但是降低了由于误诊带来的更大间接成本，我们不应只关注成本而给患者带来质量风险。总之，固体和液体组合培养的检测模式，对泌尿生殖道支原体感染的检测具有更高的敏感性和特异性。固体和液体同步接种样本，可以提高固体培养的检测效率。对液体培养疑似假阳性的样本及时转种固体培养基，兼具降低假阳性和漏诊的风险。技术人员经过简短的培训，控制影响检测质量的操作环节，新检测方案可以投入临床应用，希望本方案能在同行的临床实践中加以完善。

参考文献

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[2]KIM JK. Epidemiological trends of sexually transmitted infections among women in Cheonan， South Korea， 2006-2012 [J]. J Microbiol Biotechnol, 2013， 23(10):1484-1490.

[3]IMUDIA AN, DETTI L, PUSCHECK EE, et al. The prevalence of ureaplasma urealyticum， mycoplasma hominis， chlamydia trachomatis and neisseria gonorrhoeae infections， and the rubella status of patients undergoing an initial infertility evaluation [J]. J Assist Reprod Genet, 2008， 25(1):43-46.

[4]吴磊，杨阳，顾伟鸣．上海市医院实验室检测解脲脲原体质量分析[J]．中国皮肤性病学杂志，2009， 23(1):34-35．

[5]周运恒，马红霞，曹广亚，等. 两种培养方法检测解脲脲原体及其菌落形态学的比较研究[J]. 检验医学, 2013， 28(5):362-365.

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[8]尹跃平. 性传播疾病实验室诊断指南[M]. 上海：上海科学技术出版社，2007:99-102.

(本文编辑：范基农)

注：吴磊与周运恒对本研究具有同等贡献，并列为第一作者。

Research on the modification detection scheme for mycoplasma infection of genitourinary tractWULei1，ZHOUYunheng2，CHENXiangming3，WANGGuojiang3，LIUYing4，CHENFeng4，FENGJing5,TANGQunli5，WANGRuizhong6，FANGHua6，ZHAOHu7，FANGYi7，ZHOUChunmei8，HUANGShenglei8，TANGZhenhua9，LUTingyan9，TANGJin10，WANGJianqiang10，HANLizhong11，XIAOShuzhen11，HUWeizhong1，YANGYang1，GUWeiming1.(1.DepartmentofClinicalLaboratory，ShanghaiDermatologyHospital，Shanghai200443，China；2.DepartmentofClinicalLaboratory，ShanghaiCropsHospitalofChinesePeople′sArmedPolice，Shanghai201103，China; 3.DepartmentofVenereology,ShanghaiJadingNanxiangHospital，Shanghai201802，China; 4.DepartmentofClinicalLaboratory，XinhuaHospital，ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200092，China; 5.DepartmentofClinicalLaboratory，ShanghaiFengxianDistrictCentralHospital，Shanghai201499，China; 6.DepartmentofClinicalLaboratory，ShanghaiPudongNewAreaPeople′sHospital，Shanghai201299，China; 7.DepartmentofClinicalLaboratory，HuadongHospital，FudanUniversity，Shanghai200040，China; 8.DepartmentofClinicalLaboratory，ZhongshanHospital，FudanUniversity，Shanghai200032，China; 9.DepartmentofClinicalLaboratory，theInternationalPeaceMaternityandChildHealthHospital，ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200030，China; 10.DepartmentofClinicalLaboratory，theSixthPeople′sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200233，China; 11.DepartmentofOrganism，RuijinHospital，ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200025，China)

Abstract:ObjectiveTo optimize culture methods and processes for mycoplasma and to establish a new scheme to improve the detection accuracy of ureaplasma urealyticum (Uu) and mycoplasma hominis (Mh) infections. MethodsA practical standard laboratory procedure was established， and the models of mycoplasma culture in solid and liquid cultures were optimized. A total of 11 hospitals above Grade 2 in Shanghai participated in the study. Study cases were randomly selected， and genitourinary samples were determined. Statistical analysis was performed， and the clinical application of the procedure was evaluated. ResultsA total of 747 samples were collected. The overall positive rate was 45.1% (337/747)， for Uu 41.1% (307/747) and for Mh 13.9% (104/747). The positive coincidence percentages of original sample inoculation were 92.6% and 94.0% (P<0.01)， respectively. The positive coincidence percentages after transmission inoculation were 97.5% and 96.1% (P>0.05). The sensitivity of solid culture was improved when culture was transferred from liquid culture with color changes. A total of 17 liquid culture samples did not produce any colonies on the solid culture， and even the solid culture was passed twice. This indicated that solid culture decreased the false positivity in liquid culture. The determination time reduced significantly when solid and liquid cultures were performed simultaneously. Over 85% mycoplasma samples had colony formation within 24 h， and in 48 h liquid culture and solid culture had same positive percentage. ConclusionsThe combination of liquid culture and solid culture of mycoplasma produces high sensitivity and specificity， although the costs of the testing increase. This combination determination procedure should be recommended in the laboratory diagnosis of mycoplasma infections.

Key words:Mycoplasma; Ureaplasma urealyticum; Mycoplasma hominis; Culture; Determination method; Standardization

收稿日期：(2015-08-25)

通讯作者：顾伟鸣，联系电话：021-61833177。

作者简介：吴磊，男，1978年生，硕士，主管技师，主要从事性病检测方法学研究。

基金项目：上海市自然科学基金资助项目(06ZR14074)；吴阶平医学基金会资助项目(320.6750.13233)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)12-1214-05R446.11

文献标志码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.012