2个酶免疫分析系统检测抗HCV抗体的重复性和诊断阈值分析

孟存仁，　唐　婧，　张朝霞

(新疆医科大学第一附属医院医学检验中心，新疆 乌鲁木齐 830054)



2个酶免疫分析系统检测抗HCV抗体的重复性和诊断阈值分析

孟存仁，唐婧，张朝霞

(新疆医科大学第一附属医院医学检验中心，新疆 乌鲁木齐 830054)

摘要：目的分析2个酶免疫分析系统检测抗丙型肝炎病毒(HCV)抗体的重复性和阳性预测值≥95%时的信号/临界值(S/CO)比值。方法分别用Addcare ELISA 1100全自动酶免疫分析系统(简称Addcare系统)和TECAN+FAME组合系统，以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗HCV抗体，重组免疫印迹分析(RIBA)确认抗HCV抗体。收集高、中、低3个水平的样本，在一批检测内重复检测20次(孔)，计算分析内精密度；在10 d以上时间内单次(孔或管)重复进行20批检测，计算分析间精密度。收集202份血清，以RIBA确证试验结果为金标准，用受试者工作特征(ROC)曲线分别确定2个检测系统检测抗HCV抗体的最佳诊断阈值(S/CO比值)，并分别确定2个检测系统检测抗HCV抗体的阳性预测值≥95%时的S/CO比值的范围。结果Addcare系统和TECAN+FAME组合系统检测抗HCV抗体的分析内变异系数(CV)分别为5%、8%、10%和3%、7%、8%，分析间CV分别为8%、12%、15%和6%、10%、13%。2个酶免疫分析系统检测抗HCV抗体的最佳诊断阈值(S/CO比值)分别为3.20和2.90。2个酶免疫分析系统检测抗HCV抗体的阳性预测值≥95%时的S/CO比值范围分别为≥2.41和≥2.57。结论国产Addcare 系统和进口TECAN+FAME组合系统检测的结果重复性好，符合率高。酶免疫分析系统ELISA检测抗HCV抗体具有各自最佳的S/CO比值，且S/CO比值与确证试验阳性有一定的相关性，可用S/CO比值预测抗HCV抗体阳性。研究确定酶免疫分析系统检测抗HCV抗体最佳诊断阈值和阳性预测值≥95%时的S/CO比值有助于提高检测结果的可靠性，减少须进行确证试验的样本数。

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的丙型肝炎呈全球分布，世界人口的3%即大约1.7亿人为HCV感染者，且发展中国家高于发达国家[1]。抗HCV抗体的检测是目前应用最广泛的用于流行病学调查和临床HCV感染的检测项目，为丙型肝炎的早发现、早治疗提供可靠的依据[2]。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA )是抗HCV抗体筛查最常用的方法，但在HCV低感染率人群中，ELISA检测抗HCV抗体的假阳性问题仍较突出，因此美国疾病预防控制中心(the Center for Disease Control and Prevention, CDC)曾于1998年建议：对抗HCV抗体筛查阳性者应进一步用重组免疫印迹分析(recombinant immunoblot analysis，RIBA)或核酸检测(nucletide acid test，NAT)检验后方可报告[3]。然而这2种确证试验成本及技术要求高，目前在实际工作中尚难以推广。鉴于此，2003年美国CDC建议：可根据ELISA筛查的信号/临界值(signal-to-cut off, S/CO)比值来确定其是否需要作NAT和RIBA，并认为用S/CO比值判断真阳性，既可提高检测报告的可靠性，又可减少进一步用NAT和RIBA检测的样本数，从而大大节省检测费用[4]。目前国内尚缺乏抗HCV抗体的诊断标准及指南，由于国产试剂与进口试剂存在较大差异[5]，国外的标准可能并不适用于国产试剂。因此，本研究拟采用2种自动化酶联免疫分析仪即国产Addcare ELISA 1100全自动酶免疫分析系统(简称Addcare系统)和进口TECAN+FAME组合系统分别与同一国产试剂组成的检测系统检测抗HCV抗体的重复性、符合率、最佳诊断阈值和阳性预测值≥95%时的S/CO比值范围。

材料和方法

一、研究对象

收集2013年3至7月新疆医科大学第一附属医院医学检验中心血清样本202份，分离血清，置-80 ℃保存待测。样本来源对象男93例，女109例，年龄1～82岁，其中来自肝病科门诊和住院部(临床诊断疑似丙型肝炎患者)132份，来自普通门诊和体检中心(健康人)70份。

二、仪器和试剂

1. 检测仪器(1)Addcare系统(烟台生物科技有限公司)；(2)TECAN加样系统(瑞士帝肯公司)和FAME后处理系统(瑞士哈美顿公司)组合。(1)和(2)分别与下列“2. 抗HCV抗体检测试剂”之(1)组成检测系统。

2. 抗HCV抗体检测试剂(1) 间接ELISA检测抗HCV抗体试剂盒(北京万泰生物药业股份有限公司，批号C20130406)阳性判断限 S/CO比值≥1；(2)RIBA抗HCV抗体确证试验试剂盒(北京万泰生物药业股份有限公司，批号RC20130101)；(3)国家卫生和计划生育委员会临床检验中心提供的质控血清(浓度为1 NCU/mL，批号201206001)。所有试剂均在有效期内使用，按说明书操作。

三、方法

1. 重复性试验(1)分析内精密度的验证：高、中、低3个水平的样本，在一批检测内重复检测20次(孔)，计算所得吸光度(A)值的均值和标准差，计算分析内变异系数(coefficient of variation,CV)。(2)分析间精密度的验证：高、中、低3个水平的样本，在10 d以上时间内单次(孔或管)重复进行20批检测，计算所得A值的均值和标准差，计算分析间CV。

2. 最佳诊断阈值(S/CO比值)的确定收集202份血清，用Addcare系统和TECAN+FAME组合系统检测抗HCV抗体，同时用RIBA确认抗HCV抗体，采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分别确定2个酶免疫检测系统检测抗HCV抗体在本实验室的最佳诊断阈值(S/CO比值)。以RIBA确证试验结 果为金标准，分别确定2个检测系统检测抗HCV抗体的阳性预测值≥95%时的S/CO比值范围。

四、统计学方法

采用Excel 2010软件进行数据录入和整理，用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。用配对四格表χ2检验比较2个酶免疫分析系统以原阳性判断限所得的检测结果的差异。以RIBA确证试验结果为金标准，绘制ROC曲线，计算曲线下面积，并探讨其最佳临界值即约登指数最大时的S/CO比值，据此确定抗HCV抗体最佳诊断阈值(S/CO比值)。用配对四格表χ2检验比较ROC曲线确定的2个酶免疫分析系统检测抗HCV抗体的最佳阈值下的检测结果的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、重复性试验

1.分析内精密度的验证Addcare系统检测抗HCV抗体高、中、低3个水平的样本，分析内CV分别为5%、8%和10%。TECAN+FAME组合系统检测3个水平的样本，分析内CV分别为3%、7%和8%。

2.分析间精密度的验证Addcare系统检测抗HCV抗体高、中、低3个水平的样本，在10 d时间重复进行20批检测，分析间CV分别为8%、12%和15%。TECAN+FAME组合系统相应的分析间CV分别为6%、10%和13%。

二、 Addcare系统和TECAN+FAME组合系统与RIBA确证试验检测抗HCV抗体结果比较

1. 2个酶免疫分析系统检测抗HCV抗体的原阳性判断限下的结果比较按试剂盒规定的原阳性判断限，Addcare系统检测抗HCV抗体阳性162例，TECAN+FAME组合系统检测抗HCV抗体阳性163例，二者检测抗HCV抗体的符合率为97.5%。见表1。

表1　2个酶免疫分析系统检测抗HCV抗体的原阳性判断限下的检测结果

注：P=1.000

2. RIBA检测RIBA确证阳性142份，阴性60份。142份阳性样本的条带和强度特点见表2。

3. Addcare系统和TECAN+FAME组合系统与RIBA确证试验检测抗HCV抗体结果比较以RIBA确证试验结果为金标准，按试剂盒提供的阈值(S/CO比值=1)，Addcare系统的假阳性率为33%，TECAN+FAME组合系统的假阳性率为35%。见表3。

表2　142份RIBA阳性样本5个抗原区条带强度

表3　Addcare系统和TECAN+FAME组合系统分别与RIBA确证试验检测抗HCV抗体结果比较

三、ROC曲线确定2个酶免疫分析系统检测抗HCV抗体的检测性能

以RIBA检测结果为金标准，绘制2个酶免疫分析系统的抗HCV抗体ROC曲线，分析显示， Addcare系统检测抗HCV抗体的最佳诊断阈值(S/CO比值)为3.20，此时的敏感性和特异性分别为99.3%和96.7%，约登指数为0.960，ROC曲线下面积为0.998；TECAN+FAME组合系统检测抗HCV抗体的最佳诊断阈值(S/CO比值)为2.90，此时的敏感性和特异性分别99.3%和96.7%，约登指数为0.960，ROC曲线下面积为0.998，见图1、图2。ROC曲线确定的2个不同酶免疫分析系统检测抗HCV抗体的最佳诊断阈值(S/CO比值)下的检测结果符合率为100%，差异无统计学意义(P=1.000)。见表4。

图1　Addcare系统检测抗HCV抗体的ROC曲线图

图2　TECAN+FAME组合系统检测抗HCV抗体的

Addcare系统(S/CO比值=3.20)TECAN+FAME组合系统(S/CO比值=2.90)+-合计+1420142-06060合计14260202

四、2个酶免疫分析系统检测抗HCV抗体阳性预测值≥95%的S/CO比值范围

以RIBA确证试验结果为金标准，Addcare系统检测抗HCV抗体的S/CO比值≥2.41时，阳性预测值≥95%；TECAN+FAME组合系统检测抗HCV抗体的S/CO比值≥2.57时，阳性预测值≥95%。见表5、表6。

表5　Addcare系统不同S/CO比值时的阳性预测值

注：*为阳性预测值≥95%时的S/CO比值截点

表6　TECAN+FAME组合系统不同

注： *为阳性预测值≥95%时的S/CO比值截点

讨论

HCV的感染呈世界性分布，全球HCV感染率约为3%，约1.7亿人感染HCV，每年新增病例(300~400)万。各个国家、地区和不同人群之间存在较大差异，美国、荷兰一般人口HCV感染率为0.2%~1.8%，埃及一般人群HCV感染率可达10%~30%[6-7]。我国一般人群抗HCV抗体阳性率为3.2%，抗HCV抗体阳性率随年龄缓慢上升，男女间无明显差异[8]。

随着医学科技的不断发展，血液样本的免疫检测已经趋向于自动化、程序化，目前许多实验室都同时使用2种及2种以上不同厂家的全自动酶免疫仪器进行血液样本的ELISA检测。由于检测系统的不同，结果是否具有可比性关系到血液样本的检测质量[9]。Addcare系统和TECAN+FAME组合系统的相同之处在于使ELISA从加样到出结果的试验过程标准化、规范化，避免了手工操作的误差，提高了检测的精确度和特异性，重复性好，同时大大降低了操作人员的劳动强度，提高了工作效率，且能减少操作失误，避免交叉污染，也提高了操作人员的自身安全性，特别适合医院大批量样本的检验，能满足临床及大量体检的需求。该2个系统最大的不同之处在于Addcare系统是加样、后处理一体机，有2个工作舱(前、后舱自动转板，避免污染)，3台独立洗板机(前、后舱均可使用，每台洗板机均为96针洗板头，洗板强度大、效果好)，开放操作(易受环境温度干扰)；TECAN+FAME组合系统是TECAN加样系统和FAME后处理系统组合的酶免疫分析系统，人为转板，易污染，2台洗板机(每台洗板机均为24针洗板头，洗板效果较差)，后处理机内部操作(受环境温度干扰小)。本研究探讨现阶段临床实验室普遍采用的Addcare和TECAN+FAME组合系统使用同一国产试剂检测抗HCV抗体各自的重复性、2个系统间的符合率、最佳阈值和阳性预测值≥95%时的S/CO比值范围。

本研究结果显示，Addcare系统和TECAN+FAME组合系统检测高、中、低水平抗HCV抗体的分析内和分析间CV均符合国家卫生和计划生育委员会临床检验中心规定的ELISA分析内(≤10%)和分析间(≤15%)的范围要求。但若按试剂盒规定的原阳性判断限，Addcare系统与TECAN+FAME组合系统间检测抗HCV抗体结果的符合率仅为97.5%。

在HCV低感染率人群中，ELISA检测抗HCV抗体的假阳性问题仍较突出，据此1998年美国CDC建议，抗HCV抗体筛查阳性结果需要采用RIBA或NAT证实后方可报告阳性[3]。然而，由于RIBA或NAT对设备和技术的要求相对较高，费时、费力且费用较高，我国采供血机构和临床实验室均未对抗HCV抗体筛查阳性样本进行常规RIBA或NAT确证试验[10-11]。2003年，美国CDC根据Abbot EIA 2.0和Ortho version 3.0抗HCV抗体 ELISA对不同感染率人群的筛查结果，建议将S/CO比值≥3.8作为HCV感染阳性报告的参考阈值，即当这2种抗HCV抗体 ELISA筛查试验的S/CO比值≥3.8时，其阳性预测值≥95%，可不进行确证试验，直接报告阳性结果[12]。

为探讨国产ELISA试剂和自动化免疫分析系统检测抗HCV抗体的最佳诊断阈值，本研究以RIBA检测结果为参照，经对2个酶免疫分析系统不同诊断阈值(S/CO比值)绘制的ROC曲线分析处理，Addcare系统检测抗HCV抗体的最佳诊断阈值(S/CO比值)为3.20(敏感性和特异性分别为99.3%和96.7%)，TECAN+FAME组合系统检测抗HCV抗体的最佳诊断阈值(S/CO比值)为2.90(敏感性和特异性分别为99.3%和96.7%)，按Addcare系统和TECAN+FAME组合系统的上述最佳诊断阈值，2个系统间检测抗HCV抗体结果的符合率达100%。抗HCV抗体诊断试剂盒ELISA说明书提供的诊断阈值(S/CO比值)为1，与本研究所确定的诊断阈值相差较大，若按照说明书上提供的诊断阈值判断检测结果，会导致较高的假阳性率(Addcare系统的假阳性率为33%，TECAN+FAME组合系统的假阳性率为35%)。由于ELISA方法学上的缺陷，抗HCV抗体检测出现假阳性的原因有：(1)高球蛋白血症[13]；(2)类风湿因子的干扰，如血清或血浆样本中存在类风湿因子，则其可与固相上的IgG和酶标记的IgG结合，从而出现假阳性反应；(3)样本中超氧化物歧化酶的干扰；(4)用于固相包被的HCV基因工程抗原不纯[14]；(5)试剂的保存、运输等环节影响[15]。本研究所确定的最佳诊断阈值高于试剂盒提供的S/CO比值(≥1)，虽然TECAN+FAME组合系统的敏感性略有降低，但2个系统的特异性和阳性预测值均相应提高。

本研究以RIBA确证试验结果为金标准，国产Addcare系统ELISA检测抗HCV抗体的S/CO比值≥2.41时阳性预测值≥95%，进口TECAN+FAME组合系统ELISA检测抗HCV抗体的S/CO比值≥2.57时阳性预测值≥95%。本研究所得2个检测系统检测抗HCV抗体的阳性预测值≥95%时的S/CO比值的范围低于美国CDC建议的Abbot EIA 2.0和Ortho version 3.0的S/CO比值3.8，其中可能有检测系统和不同实验室间的操作差异，也可能与检测人群HCV的感染率有关，由此突显针对不同检测系统、不同实验室和不同感染率人群确定不同的阳性预测值≥95%的S/CO比值的必要性。我们呼吁国内不同地域的实验室开展对国内常用抗HCV抗体试剂的多中心研究，以获得国内的相应S/CO比值。在本实验室条件下，用上述2个系统检测抗HCV抗体的S/CO比值分别≥2.41和≥2.57可直接报告阳性结果，但对于S/CO比值在1.00~2.41和1.00~2.57之间的样本需要进行2种检测系统之间互相复查之后进一步考虑做确证试验。

本研究以RIBA结果为金标准，ROC曲线分析结果显示，2个酶免疫分析系统ELISA检测抗HCV抗体的最佳诊断阈值(S/CO比值)分别为3.20和2.90。2个酶免疫分析系统ELISA检测抗HCV抗体的阳性预测值≥95%时的S/CO比值的范围分别为≥2.41和≥2.57。两者的差异在于：前者是兼顾敏感性和特异性的最佳诊断阈值，关注检测系统的综合检测性能；后者则重点关注提高阳性预测值，降低假阳性率。实验室可依据检测目的决定选项。

在献血者血液筛选和临床诊断2种情况下，抗HCV抗体检测的目的有所不同。前者较强调注重假阴性，对于可疑样本一般认定为不合格；而后者需结合流行病学及临床资料，务求临床诊断准确无误，便于治疗。在临床诊断方面，抗HCV抗体检测可存在滴度波动变化和假阳性问题，所以一次抗体的检测对于诊断只能作为参考，而在治疗方面仍需综合多指标(如RIBA和NAT结果)作为实施治疗和判断预后的主要参考依据[16]。

在具一定规模的医疗机构中，2个或2个以上检测系统同时检测同一项目的现象非常普遍，如何评价定性试验检测性能，保证结果的一致性，是实验室质量保证的内容之一[17]。本研究探讨的国产Addcare系统和进口TECAN+FAME组合系统检测抗HCV抗体的重复性俱佳；在以RIBA检测结果为金标准、用ROC曲线确定各自最佳诊断阈值后，诊断性能明显改善，检测结果符合率明显提高，因此可以同时应用于抗HCV抗体的检测。本研究提供了ELISA检测抗HCV抗体筛查试验的复查标准，由于ELISA检测抗HCV抗体S/CO比值与确证试验阳性有一定的相关性，即S/CO比值可以预测抗HCV抗体真阳性，以本研究确定的阳性预测值≥95%时的S/CO比值作为是否须进行确证试验的标准，可减少须进行确证试验的样本数，从而达到在提高检测结果可靠性的同时减少人力、财力支出的目的。

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(本文编辑：姜敏)

关键词：抗丙型肝炎病毒抗体；酶联免疫吸附试验；重复性；诊断阈值

Analysis on repeatability and diagnostic threshold value of 2 ELISA systems for anti-HCV antibody determinationMENGCunren，TANGJing，ZHANGZhaoxia.(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，XinjiangUrumqi830054，China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the repeatability and signal-to-cut off (S/CO) ratio of positive predictive value ≥95% in the determination of anti-hepatitis C virus (HCV) antibody by 2 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) systems. MethodsRecombinant immunoblot analysis (RIBA) was used to confirm anti-HCV antibody. Using Addcare ELISA 1100 automatic system (Addcare system) and TECAN+FAME combined system， by indirect ELISA, anti-HCV antibody was determined. High, medium and low concentrations of samples were collected. In 1 run of determination， the determination was repeated for 20 times(holes), and the precision of intra-analysis was calculated. For more than 10 d in a single (hole or pipe), 20 runs of determinations were performed， and inter-analysis precision was calculated .A total of 202 serum samples were collected, and receiver operating characteristic (ROC) curve was used to determine the optimal diagnostic threshold value[signal-to-cut off (S/CO) ratio]of 2 ELISA systems for the determination of anti-HCV antibody. The S/CO ratio scope of positive predictive value ≥95% of anti-HCV antibody determination of 2 ELISA systems was identified. ResultsThe intra-analysis coefficients of variation (CV) were 5%， 8% and 10% for Addcare system and 3%， 7% and 8% for TECAN + FAME combined system， while the inter-analysis CV were 8%， 12%， 15% and 6%， 10%， 13%， respectively. The optimal diagnostic threshold values (S/CO ratios) of 2 ELISA systems were 3.20 and 2.90. The S/CO ratio scopes of positive predictive value ≥95% of anti-HCV antibody determination of 2 ELISA systems were≥2.41 and≥2.57. ConclusionsThe Addcare system and TECAN +FAME combined system have excellent repeatability and coincidence rate. The anti-HCV antibody determined by 2 ELISA systems has optimal S/CO ratio, and the S/CO ratio is correlated with confirmation assay positivity， so S/CO ratio can be used to predict anti-HCV antibody positivity. The optimal diagnostic threshold value and the S/CO ratio of positive predictive value≥95% are helpful for improving the results′ reliability and reducing the sample numbers of confirmation assay.

Key words:Anti-hepatitis C virus antibody;Enzyme-linked immunosorbent assay; Repeatability; Diagnostic threshold value

收稿日期：(2014-10-21)

通讯作者：张朝霞，联系电话：0991-4361446。

作者简介：孟存仁，男，1972年生，硕士，副主任技师，主要从事分子生物学检验工作。

基金项目：卫生部医药卫生科技发展研究中心专项课题(28-1-13)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)12-1175-06R446.61

文献标志码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.003