外周血miRNAs检测在类风湿关节炎中的意义研究进展

刘书中,李子全,李政垚,王以朋

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 骨科,北京市100730)



外周血miRNAs检测在类风湿关节炎中的意义研究进展

刘书中,李子全,李政垚,王以朋*

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 骨科,北京市100730)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性滑膜炎、进行性骨质破坏和关节功能丧失为特征的自身免疫性疾病，发病率约为1%，好发年龄为35-50岁，女性多于男性[1]。RA的主要病理改变为关节滑膜增厚、大量炎症细胞浸润、血管翳形成以及软骨的侵蚀与破坏，致残率高，多数患者确诊时全身多个关节已出现进行性破坏，预后较差。研究表明RA的发生与基因变异、致病性内外抗原、免疫细胞异常激活及miRNA的异常调节等多种因素有关[2]。目前RA的发病机制尚不明确，深入研究RA分子生物学特征对于RA的诊断和治疗具有重要意义。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类在真核生物中发现的长18-25个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA。研究表明miRNA的异常表达与多种疾病的发生、分级分期、耐药性、预后等密切相关，参与了细胞重要生物学行为的调控,间接地发挥“促癌和抑癌”等功能，miRNAs的深入研究为多种疾病的诊断和治疗提供了新思路。影响RA疾病预后的关键在于能否早期诊断、自身免疫反应程度和病变累及范围，研究显示外周血miRNAs水平与RA的病情进展密切相关，有望成为RA诊断及预后判断的生物学标记物及治疗靶标[3]。鉴于外周血miRNA水平与RA的相关性逐渐被发现并证实，本文就近年外周血miRNA水平在RA诊疗及预后评估领域的研究进展做一综述。

1miRNA的分子生物学特征

miRNA生成过程中,编码miRNA的基因首先在细胞核内转录,在RNA聚合酶II的作用下转录为几百至几千碱基的初级产物(pri-miRNA),pri-miRNA在核内核酸内切酶Drosha酶作用下切割成只含60-70碱基的具有茎-环结构的发夹样前体(pre-miRNA),pre-miRNA被RNAGTP2依赖的转运体exportins5转运至胞浆,在IIIDicer酶(双链RNA专一性内切酶)作用下形成具有双链结构的miRNA,在酶的作用下裂解成22个核苷酸的成熟miRNA与互补链miRNA*。而miRNA*立即被降解。

miRNA的主要分子生物学特征包括:(1)通常长度为18-25nt,3’端可以有2-3个nt的变化,长度不定。(2)广泛存在于真核生物中,不具有开放阅读框架(ORF,open read frame),不编码蛋白质。(3)成熟后的miRNA5’端为磷酸基团,3’端是羟基基团,这一特点可以使miRNA与功能性RNA降解生成片段相区分，miRNA通过与靶基因mRNA3’-UTR完全或不完全的互补配对结合,致使靶mRNA降解或翻译抑制进而调控靶基因的表达,从而影响细胞增殖、侵袭、分化和凋亡等多种生物学行为。(4)miRNA在多种种属中的表达具有保守性。(5)miRNA的表达具有时序性和组织特异性。miRNA的保守性、时序表达特异性和组织表达特异性提示其在生命活动的微观层面发挥重要作用[4]。

miRNA的功能由RNA所介导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)介导,最终引起蛋白质翻译受抑或者同源mRNA降解等生物过程[5]。大量研究显示miRNA可调节人类近60%的蛋白编码基因,miRNA与靶mRNA并非完全互补配对,平均每个miRNA可以直接调节人类200种不同的mRNA,多个miRNA可以协同调节某些特殊靶基因,多个miRNAs也可能共同调节同一基因靶点,这种协同调节模式形成复杂的调控网络，因此每一个miRNA的异常表达都有可能导致大量蛋白质的表达异常[6,7]。

2外周血miRNA检测在类风湿关节炎诊断、治疗及预后评估中的意义

2.1miRNA在外周血中的表达及检测方法

外周血miRNA可能来源于凋亡坏死肿瘤细胞、血细胞、巨噬细胞的裂解等。最新研究显示外周血miRNA可能来自组织细胞的主动分泌过程，成熟的miRNA在细胞内被脂蛋白包被成外切酶体分泌至细胞外，最终到达血液。由于大多数miRNA是由细胞分泌的，组织细胞中miRNA与循环miRNA必然有一定的联系。研究结果表明miRNA在组织和体液中具有相同的改变趋势[8]。实验表明外周血中RNA在室温下过夜、反复冻存、解冻、煮沸、过酸或过碱等恶劣情况下可以维持稳定，进一步证实了循环miRNA替代组织活检而成为新型生化指标的可能。

目前检测miRNA的方法有克隆测序、Northern印记杂交、原位杂交、基因芯片、实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)等[9]。其中应用最广泛的是qRT-PCR技术，能区分miRNA前体和成熟体，只定量具有生物活性的成熟miRNA，可精确区分同一家族中序列高度同源的miRNA，能检测只有一个碱基差别的不同miRNAs表达水平，灵敏度和特异度高，样品消耗量少，只需要l-l0ngRNA即能检测出低丰度靶miRNA，定量线性范围宽，有着在临床检测领域大规模推广的潜力。

2.2外周血miRNAs检测在RA中的意义

2.2.1外周血miR-16检测在RA中的意义Murata等[10]采用qRT-PCR技术检测RA患者、骨关节炎患者及健康对照者血浆及关节滑液中miR-16，miR-132，miR-146a，miR-155及miR-223表达水平。研究发现健康对照组血浆miR-132水平较RA组和OA组显著升高，其具有诊断意义。RA组关节滑液中miR-16、miR-146a、miR-155、miR-223浓度较OA组显著升高，可能与局部炎症刺激有关，并且血浆miR-16与miR-146a水平与疼痛关节数(tender joint count，TJC)和DAS28(28-joint Disease Activity Score)呈显著负相关，结果提示血浆miR-16表达水平可以作为RA活动的分子标志，血浆miRNAs表达水平对RA发病机制阐明及诊疗具有重要价值。此外，有研究表明血浆miRNA数量或miRNA在滑膜液和血浆中的比例与关节损伤程度密切相关。Wang等[11]应用qRT-PCR技术研究发现RA患者外周血miR-16、miR-21、miR-451、miR-223表达水平显著升高。孙寅等[12]研究表明miR-16 在血浆中的表达水平显著高于关节滑液以及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)(P<0.01)，上调变化倍数分别为8.7倍和9.6倍，miR-16在关节滑液中的表达水平高于PBMC，上调变化倍数为1.5倍，无统计学意义(P>0.05)，miR-16在RA患者血浆中的表达水平低于正常健康人，下调变化倍数为0.65倍，无统计学意义(P>0.05)，miR-16在RA患者PBMC中的表达水平显著高于正常健康人(P<0.01)，上调变化倍数为1.9倍。研究还证实血浆miR-16的表达与DAS28评分呈负相关(P<0.05)，与年龄、性别、病程、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation tate，ESR)及C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)均无关(P>0.05)，PBMC中miR-16的表达与DAS28评分、ESR 及CRP呈正相关(P < 0.05)，与年龄、性别及病程无关(P> 0.05)。研究证实检测miR-16在外周血中的表达可为临床对RA与OA进行鉴别诊断以及深入探索RA的发病机制提供新的思路，血浆miR-16的表达水平有望成为评价RA 病情活动度的有效指标。郑锡铭等[13]检测80例RA患者、32例骨关节炎(OA)患者及32例健康对照者血浆、PBMC及关节液miR-16的表达量，并与RA活动性监测指标类风湿因子(RF)、ESR、CRP进行相关性分析，结果显示RA组血浆、PBMC和关节液中miR-16相对于OA组、健康对照组表达上调(P<0.05)，血浆miR-16水平与一个或多个RA活动性监测指标呈正相关(P<0.05)。此外，Hanson等[14]首次指出miRNA 图谱可作为法医体液鉴定的方法，并发现在死亡机体的外周血及其它体液中几乎都能检测到452种miRNA，但这452种miRNA在不同体液中的表达量不同。其中外周血miR- 16能在含量仅为50pg的条件下被检测鉴别出来。

2.2.2外周血miR-146a检测在RA中的意义研究表明miR-146a功能缺陷是导致TNF-α在RA患者体内持续表达的重要原因，miR-146a可通过下调IRAK1的表达抑制滑膜成纤维细胞增殖及IL-6、IL-8等炎性细胞因子的分泌，从而发挥抑制RA滑膜炎症的作用。冯知涛等[15]应用qRT-PCR技术检测RA患者活动组24例、缓解组16例及健康对照16例PBMCs中miR-146a、miR-16表达水平，并与RA患者临床指标进行相关性分析，结果显示RA组miR-146a、miR-16的表达高于健康对照组(P<0.05)，在RA活动组与缓解组的比较中发现活动组miR-146a、miR-16表达水平高于缓解组(P<0.05)。RA组miR-146a、miR-16的表达与ESR、CRP及DAS28评分之间呈正相关(P<0.01)，与RF无相关性(P>0.05)。研究证实RA患者外周血miR-146a和miR-16表达上调，其表达水平与RA病情活动相关，提示miR-146a和miR-16的检测可作为RA病情活动的判断指标。高登文等[16]也通过研究证实RA 患者PBMC中miR-146a表达上调，其表达水平与RA病情活动程度有关。刘琴等[17]用SYBR Green I qRT-PCR检测RA患者48例(活动期30例，缓解期18例)、骨性关节炎患者22例和体检健康者25例血清miR-146a的表达水平，并进行ROC曲线分析，对各组进行ESR检测，结果表明活动期RA患者血清miR-146a相对表达水平为(2.42 ±0.75)，显著高于缓解期RA患者(1.66±0.29)、OA患者(1.12±0.43)和体检健康者(1.01±0.34 )，差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-146a诊断活动期RA的ROC曲线下面积为0.914 (95%CI：0.872-0.926)，以1.96为临界值，敏感性为95.0%，特异性为87.5%，准确性为91.9%，研究结果表明血清miR-146a水平可用于诊断活动期RA。

2.2.3外周血miR-155检测在RA中的意义Ormseth等[18]采用qRT-PCR技术分析RA患者血浆中7种miRNA表达水平，结果发现RA患者血浆中miR-155-5p、miR-15a-5p、miR-24-3p、miR-26a-5p、miR-125a-5p、miR-146a-5p及miR-223-3p表达水平均显著升高，其中miR-24-3p诊断RA准确率最高(AUROC=0.725)，研究还证实联合检测血浆miR-24-3p、miR-26a-5p和miR-125a-5p水平诊断RA准确率最高 (AUROC=0.747)，血浆miR-155-5p水平与关节肿胀评分相关(P=0.024)，血浆中7种miRNA表达水平与疾病活动度及心血管风险无显著相关性。Kaleb等[19]的实验显示在PBMC中RA患者miR-146a、miR-155、miR-132、miR-16的含量分别是健康对照组的2.6、1.8、2.0、1.9 倍，但miR-let-7a的表达在RA与健康对照组间差异无统计学意义。荀春华等[20]采用qRT-PCR检测随机选取的43例RA患者和30例健康体检者血浆和PBMC中四种miRNAs(miR-146a、miR-223、miR-16和miR-155)的表达，结果表明与对照组相比，RA组患者血浆中miR-146a和miR-155表达下调(P<0.05)，PBMC中四种miRNAs表达均上调(P < 0.05)，相关性分析显示四种miRNAs在血浆和PBMC中的表达没有明显相关性。

2.2.4外周血miR-223检测在RA中的意义Carmen等[21]选取95例RA患者，分析纳入对象经抗TNF-α/改良抗风湿药物(抗TNF-α/DMARDs)联合治疗后血清miRNA水平变化，研究表明经抗TNF-α/DMARDs联合治疗后血清miR-16-5p，miR-23-3p，miR-125b-5p，miR-126-3p，miR-146a-5p，miR-223-3p水平显著升高，此外研究还证实血浆miR-23与miR-223水平也可作为判断抗TNF-α/DMARDs联合治疗效果的新型生化指标。Mária等[22]检测RA早期(ERA)患者、RA确诊患者及健康对照者血清miR-146a、miR-155、miR-223、miR-16等表达水平，结果表明RA早期患者miR-146a、miR-155和miR-16水平较RA确诊患者显著升高，治疗3个月期间循环miR-16水平变化与RA早期患者DAS28评分改变密切相关(P=0.002)，治疗期间循环miR-223水平与C反应蛋白(P=0.008)、DAS28评分(P=0.031)、治疗3月后DAS28评分(P=0.003)及治疗12月后DAS28评分(P=0.011)密切相关，但在本研究中血清miR-16与miR-223水平不能区分ERA患者与健康对照者。该研究证实miR-16与miR-223可反映ERA疾病活性并预测疾病进展。

2.2.5其他外周血miRNAs检测在RA中的意义Geoffrey等[23]采用基因芯片及qRT-PCR技术证实miR-595和miR-1246在RA患者血清中表达水平显著升高(P=0.024，P=0.036)，并可作为RA疾病诊疗的新型生化指标。Isabelle等[24]应用qRT-PCR技术检测48例RA患者、7例骨关节炎患者及13例健康对照者全血和血清中miR-125b表达水平，研究发现在RA疾病发作期血清miR-125b水平与3月后利妥昔单抗临床治疗RA的效果呈正相关(P=0.002)，其血清表达水平可作为判断利妥昔单抗治疗效果较好的预测指标。Murata等[25]检测并验证了113例RA患者及115例健康对照者血浆miRNAs水平，结果显示miR-125a-5p、miR-24、miR-26a对RA疾病诊断具有重要价值(AUC=0.83、0.80、0.80)，并且在抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)阳性及阴性患者中表达水平无显著差异。Krintel等[26]选取89例阿达木单抗40 mg治疗患者与91例安慰组对照患者并检测377种外周血miRNA表达情况，研究发现外周血miR-22低表达与miR-886.3p高表达提示RA患者应用阿达木单抗治疗效果较为理想，联合二者预测RA患者阿达木单抗治疗效果尚需进一步研究。Yang等[27]采用qRT-PCR技术分析RA患者血清及滑液中miR-221表达水平，研究结果显示RA患者血清及滑液中miR-221表达水平显著高于健康对照组，miR-221表达下调可显著抑制促炎细胞因子及趋化因子的表达。

3结语及展望

外周血中多种miRNAs在类风湿关节炎中均有异常表达，并且其水平随着RA病情进展而相应改变。多项研究表明外周血miRNA水平可作为RA诊断、病情进展及预后评估的新型生化指标，并有望为RA的治疗提供新的靶点。

近年来，针对miRNA的研究已成为国际上热点研究内容之一，对外周血中miRNA的研究也逐渐开展，但目前miRNA的临床相关研究还缺乏大样本、多中心的数据论证。由于miRNA作用的多重性，使有关外周血miRNA的研究方向得以不断扩展。但其特异性作用机制等尚需进一步探讨，以期早日应用于临床。随着研究内容不断深入，外周血miRNAs检测将在RA的早期诊断、鉴别诊断、治疗及预后判断等诸多方面展现出更为广泛的应用前景，并且为RA的诊断、治疗及预后评估起到推动作用。

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*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)07-1212-04

(收稿日期：2015-08-12)