成人和儿童金黄色葡萄球菌感染分子流行病学研究

袁　挺，　应春妹

(1. 上海交通大学医学院附属仁济医院检验科，上海 200127;

2. 上海复旦大学医学院附属妇产科医院检验科，上海 200011)



成人和儿童金黄色葡萄球菌感染分子流行病学研究

袁挺1，应春妹2

(1. 上海交通大学医学院附属仁济医院检验科，上海 200127;

2. 上海复旦大学医学院附属妇产科医院检验科，上海 200011)

摘要：目的研究上海交通大学医学院附属仁济医院(简称上海仁济医院)及上海儿童医学中心分离的金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)的分子流行病学特征及药物敏感性状况，为临床合理用药提供依据。方法收集2012年上海仁济医院分离的313株金葡菌和上海儿童医学中心分离的153株金葡菌，采用多位点序列分型(MLST)、葡萄球菌蛋白A spa基因分型和葡萄球菌染色体mec基因(SCCmec)分型技术进行分子生物学分型，对其中的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)进行SCCmec分型；采用纸片扩散法对金葡菌进行药物敏感性分析。结果2012年上海仁济医院313株金葡菌有42.49%来自痰样本，其中MRSA 173株，检出率为55.27%；MLST结果MRSA以ST5型为主；spa基因分型结果以t002型最多，为90株，占MRSA的52.02%，其次为t030型(42株，24.28%)；SCCmec分型结果以Ⅱ型为主。上海儿童医学中心153株金葡菌有62.09%来自痰样本，其中MRSA 33株，检出率为21.57%；MLST结果MRSA以ST59型为主；spa基因分型结果以t437型最多，为14株，占MRSA的42.42%，其次为t002型(5株，15.15%)及t316型(4株，12.12%)；SCCmec分型结果以Ⅳ型为主。 药物敏感性试验结果显示上海仁济医院和上海儿童医学中心金葡菌对万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺及替加环素5种抗菌药物100%敏感，对其他抗菌药物耐药率比较高。上海儿童医学中心MRSA对环丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、克林霉素、利福平、庆大霉素的敏感性均明显高于仁济医院MRSA(P<0.01)，对头孢唑啉及红霉素的敏感性差异无统计学意义(P>0.01)。结论2012年上海仁济医院MRSA以ST5-t002-Ⅱ为主，上海儿童医学中心MRSA以ST59-t437-Ⅳ为主。相比于甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)，MRSA的克隆型别相对集中，更容易引起医院内的传播。MRSA在金葡菌中的分离率较高，临床应根据药物敏感性试验结果合理使用抗菌药物。

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)广泛分布于自然界中，是人体皮肤黏膜的常见定植菌群，主要引起化脓性感染，包括蜂窝织炎、伤口化脓、气管炎、伪膜性肠炎、脓胸、脓毒血症和中毒性休克综合征等。金葡菌感染可分医院获得性和社区获得性，是医院感染和社区感染的重要病原菌。样本送检距患者入院时间48 h外为医院获得性感染，门诊样本或样本送检距患者入院时间48 h内为社区获得性感染。耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)于1961年由JEVONS首次发现，是引起医院感染的重要病原菌之一。自我国在20世纪70年代发现第1株MRSA后，其分离率在我国迅速上升。该菌对目前临床上使用的大多数抗菌药物有很高的耐药性，并可对β-内酰胺类(包括头孢菌素、含酶抑制剂复合抗菌药物以及碳青霉烯类药物)耐药。由于MRSA可通过接触等多种途径传播而引起流行，故世界各国均将MRSA的流行情况作为长期监测的重点[1-2]。研究临床分离金葡菌的分子流行病学特征及药物敏感性状况，对于医院感染的监测和控制以及临床治疗中的合理用药具有十分重要的意义[3]。我们对2012年上海交通大学医学院附属仁济医院(简称上海仁济医院)及上海儿童医学中心金葡菌的分离情况及耐药性进行了调查。

材料和方法

一、菌株来源

收集2012年上海仁济医院分离的313株金葡菌(其中医院获得性289株，占92.33%)和上海儿童医学中心分离的153株金葡菌(其中医院获得性20株，占13.07%)，排除同一患者同一部位分离到的菌株。样本类型包括痰、分泌物、全血、咽拭子、尿液、脓液和穿刺液等。

二、试剂与仪器

1. 菌株与试剂标准菌株金葡萄(ATCC 25923)、金葡萄(ATCC 29213)购于卫生部临床检验中心；水解酪蛋白胨琼脂平板、血琼脂平板均购自英国OXOID公司。

2. 仪器全自动微生物分析系统(BD公司，美国)，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(PE公司，美国)。

三、方法

1. 菌种鉴定按《全国临床检验操作规程》第3版标准进行接种和培养。将培养于血琼脂平板上18～24 h的细菌进行革兰染色镜检、触酶试验、试管法血浆凝固酶试验等初步鉴定，全自动微生物分析系统鉴定为金葡菌。

2. MRSA鉴定将新鲜培养的金葡菌用无菌生理盐水配制成0.5麦氏浊度的菌悬液，无菌棉签蘸取菌悬液均匀涂布于厚度为4 mm 的水解酪蛋白胨琼脂平板上，待水分被吸收后，分别将苯唑西林和头孢西丁纸片贴于琼脂表面。头孢西丁含量为30 μg/片，置35 ℃孵育18 h，结果判定标准：头孢西丁抑菌圈直径≤21 mm为耐药，≥22 mm为敏感。苯唑西林为1 μg/片，在35 ℃孵育24 h，结果判定标准: 苯唑西林抑菌圈直径≤10 mm为耐药，≥13 mm为敏感。2种药物中有任一结果为耐药，则菌株对苯唑西林耐药，即为MRSA。

3. 分子流行病学分析(1)多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)：MLST是基于7个相距一定距离，且基本覆盖整个染色体管家基因的核酸序列对金葡菌菌株进行的分型方法。PCR参照ENRIGHT等[4]方法进行，测序结果在MLST官方网站数据库(http://www.mlst.net)中进行比对分析，确定序列型(sequence type, ST)。(2)葡萄球菌蛋白Aspa基因分型：该分型是一种基于葡萄球菌A蛋白基因的X区重复序列多态性的一种分析方法。PCR参照官方网站的方法进行(http://www.ridom.de/spaserver)，在官方网站根据串联重复序列特征确定型别。(3)葡萄球菌染色体mes基因(staphylococcal cassette chromosomemec, SCCmec)分型：MRSA携带的mecA基因位于葡萄球菌染色体盒mec上，利用多重PCR对SCCmec特异性靶序列进行扩增，根据扩增产物的长度及组合确定SCCmec型别[5]。

4. 体外药物敏感性试验本研究选用的14种药物敏感性纸片即头孢西丁、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺、替考拉宁、万古霉素、去甲万古霉素、红霉素、克林霉素、利福平、庆大霉素、头孢唑啉和替加环素均购自英国OXOID公司。采用纸片扩散法检测金葡菌对抗菌药物的敏感性，按美国临床实验室标准化协会(the Clinical and Laboratory Standards Institution，CLSI) M100-S19文件[6]规定的标准进行结果判定。质控菌株为金葡萄 (ATCC 25923)和金葡菌(ATCC 29213)。

四、统计学方法

分子生物学分型的结果按照国际通用方法命名。MLST方法为“ST”+“型别名称(1～4位阿拉伯数字)”；spa基因分型方法为“t”+“型别名称(3～4位阿拉伯数字)”；SCCmec使用罗马数字命名，如Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。在MRSA中，使用“MLST 型-spa型-SCCmec型”进行型别的综合命名与分析；甲氧西林敏感金葡菌(methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)中以“MLST型-spa型”进行综合命名。药物敏感性试验结果采用WHONET5.6软件进行统计学分析。结果以2010年CLSI标准进行判断[7]。组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、样本分布及构成

菌种经全自动微生物鉴定药物敏感性分析仪鉴定均为金葡菌，其中上海仁济医院金葡菌313株， MRSA 173株，检出率为55.27%。上海儿童医学中心金葡菌153株，MRSA 33株，检出率为21.57%。二者MRSA检出率差异有统计学意义(χ2=24，P<0.01)。感染的样本来源广泛，上海仁济医院和上海儿童医学中心均以痰样本最多，分别占各自金葡菌样本来源的42.49%和62.09%，见图1。

二、MLST分型

MLST结果显示，上海仁济医院313株金葡菌中共发现24种ST，其中7株未分型；173株MRSA仅有3种ST，其中ST5最多，为100株(57.80%)，见表1；140株MSSA中共发现22种ST，主要型别见表2。上海儿童医学中心153株金葡菌中共发现15种ST型，其中24株未分型；33株MRSA仅有3种ST，其中ST59 最多，为22株(66.67%)，见表3；120株MSSA中共发现13种ST，见表4。

图1　上海仁济医院和儿童医学中心样本来源及比例

三、spa基因分型

仁济医院MRSA中共发现8种型别，其中t002型最多，为90株(52.02%)，见表1。MSSA中共发现28种spa型别，主要型别见表2。儿童医学中心MRSA中共发现11种型别，其中t437型最多，为14株(42.42%)，见表3。MSSA中共发现27种spa型，主要型别见表4。

四、SCCmec分型

对上海仁济医院173株MRSA进行SCCmec分型，共发现3种SCCmec型，分别为Ⅱ型100株(57.80%)、Ⅲ型65株(37.58%)、Ⅳ 型8株(4.62%)，见表1。上海儿童医学中心33株MRSA SCCmec分型分别为Ⅱ型8株(24.24%)、Ⅲ型3株(9.09%)、Ⅳ 型22株(66.67%)，见表3。SCCmec分型与MLST结果具有一致性：所有ST239型菌株均为SCCmecⅢ型，ST5型菌株均为SCCmecⅡ型，ST59型菌株则为SCCmecⅣ型。

五、药物敏感性试验

上海仁济医院和儿童医学中心MRSA均对万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺及替加环素5种抗菌药物100%敏感，对其他抗菌药物的耐药率均比较高，MRSA的耐药率明显高于MSSA。上海儿童医学中心MRSA对环丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、克林霉素、利福平、庆大霉素的敏感性均明显高于上海仁济医院(P<0.01)，对头孢唑啉及红霉素的敏感性差异无统计学意义(P>0.01)。MSSA对抗菌药物敏感性差异无统计学意义(P>0.01)。见表5、表6。

表1　上海仁济医院173株MRSA的分子生物学分型

表2　上海仁济医院140株MSSA的分子生物学分型

表3　上海儿童医学中心33株MRSA的分子生物学分型

表4　上海儿童医学中心120株MSSA的分子生物学分型

表5　上海仁济医院和上海儿童医学中心MRSA对常用抗菌药物的耐药率比较

表6　上海仁济医院和上海儿童医学中心MSSA对常用抗菌药物的耐药率比较

续表6

讨论

金葡菌是临床常见革兰阳性球菌，从20世纪60年代首株MRSA感染病例出现以来，MRSA以惊人的速度在全球范围内广泛传播，成为医院感染中重要的病原菌[8-11]。金葡菌可引起侵袭性疾病，如皮肤软组织等局部感染和肺炎、心内膜炎等内脏器官感染以及菌血症等全身化脓性感染。金葡菌能产生多种毒素，引起急性胃肠炎、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征，这些毒素性疾病常发生于儿童，病死率明显高于成人[12]。MRSA在儿童可造成皮肤坏死性损害，如蜂窝织炎及脓肿等，很多都需要外科干预[13]，也可引起致死性肺炎和败血症等重症感染[14]。由社区获得性MRSA引起的坏死性肺炎是儿童社区获得性MRSA感染死亡的主要原因[15]。随着各类抗菌药物的临床广泛应用，MRSA的分离率也随之显著升高，临床治疗十分困难[16]。我国细菌耐药性监测网2011年的数据显示，MRSA平均分离率为50.6%[17]，本研究2012年收集的上海仁济医院金葡菌MRSA的分离率为55.27%，高于全国水平；上海儿童医学中心的分离率为21.57%，低于全国水平。二者差异具有统计学意义(P<0.01)。可能原因为上海仁济医院分离的金葡菌绝大多数为医院获得性的，上海儿童医学中心医院获得性金葡菌较少，而医院获得性金葡菌分离者绝大多数具有反复、长期抗菌药物使用史，使得医院获得性MRSA分离率明显高于社区获得性MRSA。

金葡菌的分子生物学分型有助于判断菌株的亲缘关系，对医院内MRSA的感染控制具有重要意义。目前主要的分型方法有脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)、MLST、spa基因分型和SCCmec分型。其中PFGE的分辨率最高，但需要特殊的仪器，操作复杂、耗时，并且缺乏实验室间的可比性，因此不适用于长时间、大规模的监测[18]。相比之下，MLST、spa基因分型在国际范围内已有标准、统一的操作方法及命名体系，能够实现在不同实验室、地区甚至国家之间的对比，适于研究群体生物性和长期大范围、全球性的流行病学调查研究。2种方法分型结果具有相关性，但spa基因分型的分辨率更高[4，18]。SCCmec基因分型基于决定对甲氧西林及其他相关药物耐药的耐药基因盒，因此仅适用于MRSA的分型，并且分辨率是最低的。在全世界范围内仅发现11种不同的SCCmec型别[19]。本研究显示上海仁济医院MRSA MLST结果以ST5为主，上海儿童医学中心以ST59为主。spa基因分型结果上海仁济医院MRSA以 t002型最多，为90株，占MRSA的52.02%，其次为t030(42株，24.28%)；上海儿童医学中心MRSA以t437型最多，为14株，占MRSA的42.42%，其次为t002型(5株，15.15%)及t316型(4株，12.12%)。 SCCmec分型结果上海仁济医院以Ⅱ型为主，上海儿童医学中心以Ⅳ型为主。有报道，医院获得性MRSA通常携带SCCmecⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型中的一种，而社区获得性MRSA则携带Ⅳ 型或Ⅴ型[20]，本研究与其基本一致。

药物敏感性试验显示MRSA耐药广泛，不仅对β-内酰胺类抗菌药物耐药，而且还对大环内酯类、四环素类等常用抗菌药物普遍耐药。本研究未发现对万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、替加环素耐药的金葡菌。上海儿童医学中心MRSA对环丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、克林霉素、利福平、庆大霉素敏感性均明显高于上海仁济医院(P<0.01)，对头孢唑啉及红霉素敏感性差异无统计学意义(P>0.01)，可能与Ⅳ型除了携带有mecA基因外不携带其它的耐药基因，所以耐药性不高有关[21-24]。此外还有一个重要原因，上海儿童医学中心在为儿童选用抗菌药物方面考虑到儿童身体发育不完全，坚持尽量少用抗菌药物，尽量用低等级抗菌药物，尽量不联合用药的原则，从而保证了儿童的用药安全，减少了耐药菌的产生。而在成人用药方面目前我国做得尚有欠缺，应根据药物敏感性试验结果合理选用抗菌药物。随着临床药物的频繁使用，国外已出现对糖肽类抗菌药物敏感性降低MRSA感染的报道[25]，给临床选用抗菌药物进行有效治疗带来巨大压力。因此，对于该类抗菌药物的使用更应慎重，以延缓和减少耐药菌株的产生。

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关键词：金黄色葡萄球菌；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；药物敏感性试验；分子生物学分型；流行病学分析

Molecular epidemiology research ofStaphylococcusaureusinfection from adult and child patientsYUANTing1,YINGChunmei2. (1.DepartmentofClinicalLaboratory,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiObstetricsandGynecologyHospital,FudanUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the molecular epidemiology characteristic and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus (S. aureus) isolated from Renji Hospital affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine (Shanghai Renji Hospital) and Shanghai Children′s Medical Center in order to provide reference for the rational use of clinical medication. MethodsIn 2012, 313 S. aureus isolated from Shanghai Renji Hospital and 153 S. aureus isolated from Shanghai Children′s Medical Center were collected and analyzed by multilocus sequence typing (MLST) and Staphylococcus protein A spa gene typing. In addition, staphylococcal cassette chromosome mec(SCCmec) typing was performed for methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA). Antimicrobial susceptibility test was detected by Kirby-Bauer method. ResultsThere were 313 isolates of S. aureus isolated from Shanghai Renji Hospital in 2012, mainly isolated from sputum, accounting for 42.49%, 173 isolates were MRSA, and the detection rate was 55.27%. The predominant type of MLST was ST5. The predominant type of spa gene typing was t002(90 isolates, 52.02%), and next type was t030(42 isolates， 24.28%). The predominant type of SCCmec typing was Ⅱ. There were 153 isolates of S. aureus isolated from Shanghai Children′s Medical Center, mainly isolated from sputum, accounting for 62.09%, 33 isolates were identified as MRSA, and the detection rate was 21.57%. The predominant type of MLST was ST59. The predominant type of spa gene typing was t437(14 isolates, 42.42%), and next type was t002(5 isolates, 15.15%) and t316(4 isolates, 12.12%). The predominant type of SCCmec typing was Ⅳ. The antimicrobial susceptibility test showed that all the S. aureus isolates were 100% sensitive to vancomycin, norvancomycin, teicoplanin, linezolid and tetracycline, and drug resistance rate was obviously lower than others. The drug resistance rates of MRSA from Shanghai Children′s Medical Center to ciprofloxacin, moxifloxacin, levofloxacin, clindamycin, rifampicin and gentamicin were significantly higher than those from Shanghai Renji Hospital(P<0.01).For cefazolin and erythromycin, there was no statistical significance(P>0.01). ConclusionsThe type of ST5-t002-Ⅱis the major epidemic MRSA type in Shanghai Renji Hospital, and ST59-t437-Ⅳ is the major epidemic MRSA type in Shanghai Children′s Medical Center in 2012.Unlike methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA), MRSA shows clustered clonal types, suggesting a nosocomial spread in hospital. The isolation rate of MRSA in S. aureus is high. Clinic should rationally use antimicrobial agents according to the results of drug susceptibility.

Key words:Staphylococcus aureus; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Antimicrobial susceptibility test; Molecular biology typing; Epidemiology analysis

收稿日期：(2015-03-07)

通讯作者：应春妹, 联系电话：021-63455050-8394。

作者简介：袁挺，男，1980年生，硕士，主管技师，主要从事细菌耐药机制研究。

中图分类号：(本文编辑：姜敏)

文章编号：1673-8640(2015)11-1119-06R378.1 1673-8640(2015)11-1125-03R446.1

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.014 ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.015