ALT催化活性测定中不同厂家或批号试剂不确定度的评定



ALT催化活性测定中不同厂家或批号试剂不确定度的评定

国内外不同参考实验室对丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)催化活性浓度的测定均使用国际临床化学和检验医学联合会(the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC)推荐的参考测量程序，但测量结果仍存在差异。每年参加国际参考实验室间质量评价(RELA)计划[1]的国内外参考实验室达数十家，各参考实验室相同样本中ALT催化活性的测定结果都不尽相同，有些甚至存在较大差异[2]。我们旨在通过研究不同厂家或批号试剂对ALT催化活性浓度的影响，从而判断试剂厂家或批号的不同是否是导致各参考实验室对ALT测定结果产生差异的原因之一。同时，由于目前在不确定度评估中考虑不同厂家和批号试剂的文献很少，我们通过比较不同厂家或批号L-丙氨酸、α-酮戊二酸、还原型btea-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(beta-nicotinamide adenine dinucleotide reduced disodium salt hydrate，NADH)和三羟甲基氨基甲烷(Tris hydroxyl methyl aminomethane，Tris)对ALT催化活性浓度的影响，评估由它们所引起的不确定度，筛选出较好的试剂厂家，作为参考实验室评定测量结果不确定度时的参考。

材料和方法

一、标本血清收集

根据国际标准化组织(the International Organization for Standardization，ISO)导则34[3]，收集南通大学附属医院健康体检者混合新鲜血清，人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)均为阴性，共5个浓度水平(S1～S5)，ALT浓度范围分别为30～50 U/L(S1)、60～80 U/L(S2)、90～110 U/L(S3)、120～140 U/L(S4)、180～200 U/L(S5)，并剔除溶血、黄疸、乳糜血标本。

二、主要试剂及仪器

L-丙氨酸购自Sigma-Aldrich公司(简称Sigma公司，批号1为SLBF7656V、批号2为091M1228V)、苏州亚科化学试剂股份有限公司(简称为亚科公司，批号1为YK2013040701、批号2为YK2013072001)、东京化成工业株式会社(简称TCI公司，批号为WF8HE-BD)。Tris购自Sigma公司(批号1为SLBC3621V、批号2为SLBF5096V)、亚科公司(批号1为YK2013120501、批号2为YK2013110901)、TCI公司(批号为3VF5B-IF)。α-酮戊二酸购自Sigma公司(批号1为BCBC2051V、批号2为BCBK2005V)、亚科公司(批号1为YK2013101801、批号2为YK2013071501)、TCI公司(批号为MTQWG-EA)。NADH购自Sigma公司(批号1为SLBG3492V、批号2为SLBC9397V)、亚科公司(批号1为YK2013112501、批号2为YK2013122501)、TCI公司(批号为3MVMN-IN)。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)(批号099K7415V)、 5′-磷酸吡哆醛(批号SLBB2566V)、牛血清白蛋白均购自Sigma公司。Cary 4000紫外/可见分光光度仪(美国安捷伦公司)；Hanna HI98183型pH酸度计(意大利哈纳公司)；Fluke 1521点式温度计(美国福禄克公司)；Sartorius BT25S电子天平(德国赛多利斯公司)；DKB-501A型超级恒温水槽(北京格瑞恩公司)；5 000和200 μL Eppendorf Reference移液器各1支。

三、方法

对S1～S5共5个浓度水平的血清分别进行测定，每个厂家或批号的试剂分别测定S1～S5血清各5次，连续测定4 d。以不同厂家L-丙氨酸对ALT催化活性浓度影响为例，保持其他试剂3种成份不变(使用Sigma批号1试剂)，分别改变L-丙氨酸的厂家和批号，配制试剂，进行ALT活性浓度的测定。

参照IFCC推荐的ALT参考测量程序[4]，在Cary 4000紫外/可见分光光度仪的反应杯内加入2.000 mL反应液和0.200 mL混合血清标本，完全混合并孵育300 s，在300 s末加入0.200 mL的起始反应液，延滞90 s，测量180 s内吸光度的变化率，计算ALT催化活性。

四、统计学方法

对参考方法所测结果采用MedCalc软件进行Bland-Altman一致性分析[5]。Bland-Altman 分析法以2个不同厂家或批号试剂的平均值为横坐标，以它们的差值为纵坐标，标绘出散点图[6]，并以差值的均数(±1.96s)为95%的一致性界限，当95%的点都在一致性区间内，且该变异范围满足临床可接受范围及平均偏倚低于IFCC参考方法允许变异范围(5.25%)[7]，则可以认为这2种方法具有较好的一致性。

不同厂家或批号试剂间的不确定度(u)计算参照单因素方差分析进行计算。

扩展不确定度(U)=k×uc (k=2)

结果

一、不同厂家L-丙氨酸对ALT催化活性浓度的影响

不同厂家L-丙氨酸对ALT催化活性浓度的影响见表1。不同厂家或批号L-丙氨酸对ALT催化活性浓度影响的Bland-Altman一致性分析结果见图1。对于同一厂家不同批号的L-丙氨酸，Sigma公司2个批号与亚科公司2个批号对ALT催化活性浓度一致性好；对于不同厂家的L-丙氨酸，Sigma公司与TCI公司对ALT催化活性浓度一致性较好。不同厂家L-丙氨酸的u为0.9%。

表1　不同厂家或批号L-丙氨酸测定ALT催化活性浓度

图1　不同厂家或批号L-丙氨酸对ALT催化活性浓度影响一致性的Bland-Altman图

二、不同厂家α-酮戊二酸对ALT催化活性浓度的影响

不同厂家α-酮戊二酸对ALT催化活性浓度的影响见表2。不同厂家或批号α-酮戊二酸对ALT催化活性浓度影响的Bland-Altman一致性分析结果见图2。对于同一厂家不同批号的α-酮戊二酸，Sigma公司2个批号对ALT催化活性浓度一致性好，亚科公司2个批号α-酮戊二酸对ALT催化活性浓度一致性较差；对于不同厂家的α-酮戊二酸，Sigma公司与TCI公司对ALT催化活性浓度一致性好。不同厂家α-酮戊二酸的u为0.65%。

表2　 不同厂家或批号α-酮戊二酸测定ALT催化活性浓度

图2　不同厂家或批号α-酮戊二酸对ALT催化活性浓度影响一致性的Bland-Altman图

三、不同厂家NADH对ALT催化活性浓度的影响

不同厂家NADH对ALT催化活性浓度的影响见表3。不同厂家或批号NADH对ALT催化活性浓度影响的Bland-Altman一致性分析结果见图3。对于同一厂家不同批号的NADH，Sigma公司2个批号与亚科公司2个批号对ALT催化活性浓度一致性好；对于不同厂家的NADH，3家公司对ALT催化活性浓度一致性均好。不同厂家NADH的u为0.58%。

表3　 不同厂家或批号NADH测定ALT催化活性浓度

图3　 不同厂家或批号NADH对ALT催化活性浓度影响一致性的Bland-Altman图

四、不同厂家Tris对ALT催化活性浓度的影响

不同厂家Tris对ALT催化活性浓度的影响见表4。不同厂家或批号Tris对ALT催化活性浓度影响的Bland-Altman一致性分析结果见图4。对于同一厂家不同批号的Tris，Sigma公司2个批号和亚科公司2个批号对ALT催化活性浓度一致性好；对于不同厂家的Tris，Sigma公司及TCI公司对ALT催化活性浓度一致性均较好。不同厂家Tris的u为0.23%。

表4　 不同厂家或批号Tris测定ALT催化活性浓度

图4　 不同厂家或批号Tris对ALT催化活性浓度影响一致性的Bland-Altman图

五、不同厂家或批号试剂不确定度评定结果

ALT试剂各成分(L-丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH、Tris)不同批号及不同厂家的u分别为0.90%、0.65%、0.58%、0.23% 。不同厂家或批号试剂对ALT催化活性浓度影响为：

U=1.27×2=2.54%(k=2)

讨论

本研究使用的Bland-Altman分析法是由BLAND等[8]于1986年提出的。它的基本思想是计算出2种测量结果差值的95%一致性界限。如果这个界限在临床实际可接受的范围内，则可以认为这2种测量方法有较好的一致性，2种方法可以互换使用。反之还不能认为2种方法可以互换。它解决了相关分析不能解决的问题，是一种评价2种测定方法结果一致性的科学、简单、直观的统计方法。

本研究结果显示，通过Bland-Altman一致性分析，在测定ALT催化活性浓度的过程中，同一厂家不同批号之间一致性较好，可互换使用；而对于不同厂家的试剂，实验结果有一定的差异，因此实验室如果在更换试剂厂家时应对试剂进行评价，以保证实验室结果的一致性和准确性。

不同厂家或批号试剂对ALT催化活性浓度影响的uc为1.27%，U为2.54%(k=2)。查阅国内外相关文献，目前针对不同厂家或批号试剂所引起的不确定度方面研究较少，其中德国临床化学与检验医学协会参考实验室2提供的不同试剂批号引起的不确定度为1.5%，与本研究结果有一定差异。其原因是本研究在考虑不同批号试剂的基础上增加了不同厂家试剂之间的差异。

在国际RELA比对试验中，各参考实验室间对同一样本所测得ALT催化活性浓度存在较大差异(见图5和图6)[2]，试剂厂家或批号不同是原因之一。因此，为了使各参加RELA比对的参考实验室和候选参考实验室对ALT催化活性浓度测定的结果更具可比性和一致性，应规定所使用的各种试剂的厂家。

图5　2013年低值ALT催化活性浓度测定RELA比对结果

图6　2013年低值ALT催化活性浓度测定RELA比对结果

在今后的研究中，我们将分析不同厂家试剂对ALT催化活性浓度影响的原因，是否为杂质影响(杂质存在抑制剂或激活剂等)，同时进行长期实验，增加更多的试剂厂家和批号，累积更多的实验数据，为参考实验室评定测量结果不确定度提供参考。

参考文献

[1]迟珊，沈默，张曼. γ-谷氨酰基转移酶国际室间比对计划结果分析[J].检验医学，2011，26(8)：540-543.

[2]International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. RELA -- IFCC external quality assessment scheme for reference laboratories in laboratory medicine[EB/OL]. (2015-01-14)[2015-01-14]. http://www.dgkl-rfb.de:81/.

[3]International Organization for Standardization. General requirements for the competence of reference material producers[S].ISO Guide 34，ISO，2009.

[4]SIEKMANN L，BONORA R，BURTIS CA，et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C. International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Part 7. Certification of four reference materials for the determination of enzymatic activity of gamma-glutamyltransferase, lactate dehydrogenase, alanine aminotransferase and creatine kinase accord [J]. Clin Chem Lab Med，2002，40(7)：739-745.

[5]LUDBROOK J. Confidence in Altman-Bland plots: a critical review of the method of differences[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol，2010，37(2):143-149.

[6]陈卉.Bland-Altman分析在临床测量方法一致性评价中的应用[J].中国卫生统计，2007，24(3): 308-309.

[7]陈宝荣，孙慧颖，邵燕,等.四种血清a-淀粉酶厂家系统测量结果的正确性评价[J].中华检验医学杂志，2012，35(4):309-316.

[8]BLAND JM，ALTMAN DG.Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement[J] . Lancet，1986，1(8476): 307-310.

(本文编辑：龚晓霖)

顾文超1，王惠民1，季伙燕1， 王建新2，张卫威1，孟舒婷1，许丽丽1

(1.南通大学附属医院检验科，江苏 南通 226001；2.南通大学检验医学研究所，江苏 南通 226001)

摘要：目的研究不同厂家或同一厂家不同批号的L-丙氨酸、α-酮戊二酸、还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH)和三羟甲基氨基甲烷(Tris)对丙氨酸氨基转移酶(ALT)催化活性浓度的影响，评定ALT催化活性测定中不同厂家或批号试剂不确定度。方法按照国际临床化学和检验医学联合会推荐的ALT参考测量程序(37 ℃)，分别测定S1～S5共5个浓度水平血清，用Bland-Altman法分析其一致性，并计算不同厂家或批号试剂间的不确定度。结果ALT试剂各成分(L-丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH、Tris)不同厂家及批号的不确定度分别为0.90%、0.65%、0.58%、0.23%，对ALT催化活性浓度影响的扩展不确定度为2.54%(k=2)。结论要使各参考实验室所测定的ALT催化活性浓度结果更具可比性，应规定各使用试剂厂家及批号，并在不确定度评定中考虑不同厂家或批号试剂的不确定度。

关键词：不确定度；丙氨酸氨基转移酶；催化活性；L-丙氨酸；α-酮戊二酸；还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐；三羟甲基氨基甲烷

Estimation on the uncertainty of ALT catalytic activity with different manufacturers or different lot numbersGUWenchao1,WANGHuimin1，JIHuoyan1 ,WANGJianxin2，ZHANGWeiwei1，MENGShuting1，XULili1.(1.DepartmentofClinicalLaboratory，theAffiliatedHospitalofNantongUniversity，JiangsuNantong226001，China； 2.TheLaboratoryMedicineInstituteofNantongUniversity，JiangsuNantong226001,China)

Abstract:ObjectiveTo research the influence of L-alanine, alpha-ketoglutaric acid, beta-nicotinamide adenine dinucleotide reduced disodium salt hydrate(NADH) and Tris hydroxyl methyl aminomethane(Tris) coming from different manufacturers or different lot numbers on alanine aminotransferase (ALT) catalytic activity, and to evaluate the uncertainty of ALT catalytic activity with different manufacturers or different lot numbers. MethodsThe sera with 5 concentrations(S1-S5) were measured by the reference method (37 ℃) recommended by the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. The consistency was analyzed by Bland-Altman method, and the uncertainties of ALT with different manufacturers or lot numbers were calculated. ResultsThe uncertainties of L-alanine, alpha-ketoglutaric acid, NADH and Tris were 0.90%, 0.65%, 0.58% and 0.23%. The expanded uncertainties of different manufacturers or lot numbers of reagents were 2.54%(k=2). ConclusionsIt is supposed to define every reagent manufacturer and lot number to make ALT catalytic activity measured by reference laboratories more comparable. When evaluating the uncertainty, we should consider the influence of reagents with different manufacturers or different lot numbers.

Key words:Uncertainty；Alanine aminotransferase；Catalytic activity；L-alanine；Alpha-ketoglutaric acid；Beta-nicotinamide adenine dinucleotide reduced disodium salt hydrate；Tris hydroxyl methyl aminomethane

收稿日期：(2015-01-15)

通讯作者：王惠民，联系方式：0513-85052102。

作者简介：顾文超，女，1989年生，学士，主要从事酶学及生物化学检验工作。

基金项目：国家质检总局资助项目(201210066)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)11-1150-07R446.1

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.021