G蛋白偶联受体偏倚配体及其在心血管药物研究中的应用

陈挺 张雪 翁海旭 马超群 郑兴 肖良

G蛋白偶联受体偏倚配体及其在心血管药物研究中的应用

陈挺 张雪 翁海旭 马超群 郑兴 肖良

G-蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor, GPCR）药物是目前临床上应用最为广泛的一类药物，约占整个药品市场份额的1/3。其中，它在心血管疾病中的应用尤为突出，包括降压、强心、防止血栓形成等各个方面[1]。近年来，随着对GPCR功能认识的不断深入，越来越多的药理学和遗传学研究表明，GPCR信号通路具有靶向效应[2]。“偏倚配体”是一类可以将受体选择性地稳定在不同构象的配体分子，能够激活GPCR下游某些特定的信号通路，从而避免通路全部激活产生的不良反应，具有非常广阔的临床应用前景[3]。

1 G蛋白与β-arrestin介导的GPCR信号通路

GPCR基因家族在人类基因组中最为庞大，几乎表达于机体所有组织中并影响体内几乎所有的生理反应。GPCR与激素、神经递质以及代谢产物等细胞外信号结合后发生构象变化，通过偶联的相关功能蛋白触发细胞内的信号反应。越来越多的研究表明，除异三聚体G蛋白之外，GPCR还可以偶联多种细胞内信号蛋白并介导特定的信号通路[4]。作为许多功能蛋白的支架，β-arrestin是其中最为普遍的、发挥重要功能的调节蛋白，在有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、酪氨酸激酶信号通路以及磷酸酶相关的信号通路等多种信号通路中，它可以使胞内信号蛋白之间的联系更为紧密从而有利于通路的活化[5]。随着基因芯片等技术的应用，人们逐渐发现GPCR是通过复杂的信号网络来发挥功能效应的GPCR药理学概念将突破传统标准得到不断更新。

2 配体偏倚理论

经典的受体药理学认为配体分子（激动剂或抑制剂）与某一特定GPCR结合后引起受体构象变化，通过单一的信号机制来发挥特定的功能效应。在这种模式主导下，经典受体药理学根据单一配体-受体结合的亲和力和效力差异将GPCR配体分为完全激动剂、部分激动剂、中性拮抗剂以及反向激动剂等类型。然而最新研究表明，除亲和力和效力外，不同GPCR配体分子（激动剂或抑制剂）还可以结合相同或不同的GPCR触发更为广泛的信号网络，通过对不同信号通路的选择性而发挥特定的功能效应与药理作用[4]。

最早关于偏倚配体的描述来源于α2肾上腺素受体（α2adrenergic receptor,α2-AR）的几种激动剂可以分别偶联Gαs、Gαi而产生不同效应的发现，研究者们据此推测不同配体分子可以通过诱导其受体的不同构象变化而产生特定的药理作用。此后，不同垂体腺苷酸环化酶激活肽类似物引起完全相反的药理效应、不同激动剂引起受体内化的差异等研究进一步支持了配体偏倚的理论。研究证实，偏倚配体能够直接将受体稳定在不同的构象，激活特定的受体下游信号通路[6]。配体偏倚与系统无关，是配体-受体相互作用的固有特性，仅与细胞类型以及受体密度等因素有关[7]。尽管理论上配体偏倚可以发生于既定受体的任意两个信号通路之间，如G蛋白与G蛋白之间的偏倚、β-arrestin不同亚型之间的偏倚甚至β-arrestin不同状态之间的偏倚等，但G蛋白和β-arrestin偶联是配体作用于受体后细胞内应答的第1步，且多数GPCR至少偶联1个G蛋白和1个β-arrestin。因此G蛋白和β-arrestin之间的偏倚非常有利于实现GPCR的功能选择性，代表了受体偏倚理论的一般机制，也是目前偏倚配体机制研究的热点以及偏倚配体新药研究的直接靶标[8-9]。

一般地，配体可以通过竞争受体内源性激动剂的结合位点或占据发挥特定变构调节作用的结合位点产生偏倚作用，目前配体偏倚的研究多围绕受体内源性配体或某些常用的药物相关信号通路进行。其中正位偏倚配体可能是参与完全激动剂引发的部分受体构象变化而产生对下游信号通路的功能选择性。而变构偏倚配体则可能是通过作用于一个非标准的结合位点使受体直接稳定在特定的“活性”构象（变构激活）或者通过正位激动剂使受体不能形成某些特定构象（变构调节）而实现其功能选择性，如CRTH2配体可以在不影响G蛋白信号通路的情况下阻断激动剂对β-arrestin信号通路的激活效应、M1受体变构调节剂BQCA可以促进β-arrestin的结合以及NK2受体的配体LPI805促进Gαs的解离和Gαq的结合等[10-12]，这种类似于变构调节的功能选择性被称为“偏倚变构调节”，在偏倚配体新药研究中得到了广泛应用。

3 心血管受体的重要偏倚配体

心血管系统GPCR是目前新药研究最成功的靶点，其中血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）1型受体（AT1R）、β肾上腺素能受体（β-Adrenergic Receptor,β-AR）以及烟酸受体是目前研究最多的心血管系统GPCR，也是偏倚配体新药研究最具临床应用潜力的作用靶点。

3.1 AT1R AngⅡ是肾素-血管紧张素系统的关键产物之一，能够作用于AT1R等GPCR调节血管收缩和醛固酮分泌，在水电解质平衡过程中发挥重要作用。AT1R主要通过偶联Gαq介导下游信号通路，对细胞内调节进行精细调控并广泛参与其他信号通路的活化，包括PKC与GPCR激酶（G-protein-coupled receptor kinase, GRK）的磷酸化、受体内化、β-arrestin的募集与信号通路的活化、表皮生长因子受体的反式激活以及Src蛋白和JAK/STAT的激活等[13-14]。

AT1R介导的信号通路并不完全依赖于G蛋白，可以被偏倚配体活化。目前研究主要是通过诱导关键氨基酸突变来研究AngⅡ对AT1R构象的影响及其信号通路，如大鼠AT1aR的DRY模体（氨基酸125-127）突变可以阻断其与Gαq偶联但不影响AngⅡ引起的受体磷酸化、内化以及β-arrestin的募集等过程[15]，AT1R第2个胞内环突变会阻断其与Gαq或Gαi的偶联等[16]。体外siRNA干扰或体内基因敲除β-arrestin1或β-arrestin2的研究则表明β-arrestin参与了AT1R介导的ERK1/2、RHO、Mnk1、MDM2等多条信号通路活化过程[17-18]。研究还发现机械拉伸作用可以激活β-arrestin2而非G蛋白依赖性的信号通路，与ARB作用类似，AT1R或β-arrestin2敲除均会促进拉伸诱导的细胞凋亡，说明β-arrestin2在AT1R介导的药理过程中发挥保护心脏的作用[19]。

使用选择性激活β-arrestin信号通路的偏倚配体可以强化β-arrestin对AT1R的功能影响，如最为常用的AT1R偏倚配体1Sar-4Ile-8Ile-AngⅡ（SⅡ）可以通过偶联β-arrestin促进AT1R磷酸化、内化及ERK的活化，却不会偶联G蛋白而避免促磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol,PI）在细胞膜上的翻转[20]。另外，SⅡ偶联β-arrestin后介导的ERK1/2信号通路可以促进蛋白质合成、生长与增殖，减少细胞凋亡以及增强心脏收缩力等，而不会出现AngⅡ结合后ERK1/2活化引起的心肌肥厚。这表明利用SⅡ等偏倚配体与内源性AngⅡ竞争AT1R，可以在拮抗部分AT1R不良反应的同时选择性增强偏倚配体信号通路的药理效应。之后，研究者们最近发现了一种比SⅡ效力更强的选择性激活β-arrestin信号通路的AT1R偏倚配体TRV120027[21]，其优势在于拮抗AngⅡ引起的高血压的同时更高效地竞争AT1R从而增加心肌收缩力，改善心脏功能。相比之下，经典ARB与TRV120027的降压效果相当，但无法改善心脏功能甚至在某些情况下会导致心脏功能的恶化[21]。对犬心力衰竭模型的研究表明，TRV120027可以降低动脉血压和肺毛细血管楔压，同时增加心输出量、保护肾功能并改善急性心力衰竭症状，有望成为偏倚配体临床药物开发的典范[22-23]。

因此，从信号通路研究有效性的角度来看，AT1R是一个偏倚配体作用有效、药理学效力明确的可用于新药研究的成功例证。其偏倚配体如TRV120027不仅具有ARB抑制肾素-血管紧张素系统降血压的功能，还具备β-arrestin信号通路激活的特定药理学作用，可能对急性心力衰竭、心功能下降以及神经内分泌过度活化和系统性全身血管阻力升高等疾病具有良好的治疗或保护作用[24]。

3.2 β-AR β-AR阻滞剂自发现以来一直都是临床上最重要的心血管系统药物之一，能够抑制内源性儿茶酚胺激活心脏β1-AR信号通路产生的变时、变力、变传导作用，是目前临床上治疗心肌梗死、心律失常以及高血压等心血管疾病的最常用药物。相反，β2-AR激动剂能够激活β2-AR信号通路而降低外周血管张力，也可降低气道收缩性治疗哮喘等呼吸系统疾病。

β-AR阻滞剂的疗效非常显著，以致于人们一度认为偏倚配体增强其疗效的利用空间十分有限。然而，最近研究发现β1-AR通过偶联β-arrestin可以磷酸化EKR1/2、反式激活EGF受体，发挥心脏保护作用[25]。进一步β1-AR基因突变研究发现，长期异丙肾上腺素刺激对GRK磷酸化位点表达缺失的GRK-β1AR[26]转基因小鼠（不能募集β-arrestin）的心脏功能有损伤作用，而不会对PKA磷酸化位点缺失的PKA-β1AR转基因小鼠（不能通过PKA脱敏）的心脏功能产生影响，提示β1-AR偶联的G蛋白和β-arrestin信号通路之间存在一个与细胞凋亡相关的长期正性肌力作用和心脏保护作用之间的平衡。在β-arrestin信号通路缺失、平衡被打破的情况下，单独偶联G蛋白介导的信号通路会增加细胞凋亡并损伤心脏功能。另一条β1-AR激动剂相关的信号通路是心肌梗死后Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/ calmodulin-dependent kinaseⅡ,Ca2+/CaMKⅡ）的活化。研究发现β-arrestin2对β1-AR募集激活Ca2+/CaMKⅡ并活化下游信号通路引起心脏功能的下降是十分必要的[27]，理论上这条通路可以抵消β1-AR偶联β-arrestin发挥的心脏保护作用。但由于β1-AR偶联β-arrestin激活Ca2+/CaMKⅡ的过程中需要cAMP，这条通路不大可能是由拮抗G蛋白通路cAMP生成的β-arrestin介导，β-arrestin偏倚配体的总药理效应还应该是发挥心脏保护作用的。因此，非G蛋白依赖性偶联β-arrestin信号通路的偏倚配体具有拮抗β1-AR信号通路、降低心脏功能的潜力。在最近一项研究测试的20种β-AR阻滞剂中，只有卡维地洛和阿普洛尔能够激活β-arrestin介导的EGF受体反式激活信号途径，发挥心脏保护作用[28]。研究表明，卡维地洛在治疗心肌梗死后的心血管事件以及降低病死率方面具有较其他β-AR阻滞剂更大的优势[29]。

4 偏倚配体新药研究的验证与挑战

与传统药物靶点相比，偏倚配体的药物开发更为复杂，因为它不仅需要验证新药靶点的相关性及其调节疾病状态的潜力，还至少要检测一条受体后不良反应相关的信号通路，从而在疾病中选择最佳的药物干预措施。尽管目前发现AT1R、β-AR及GPR109a等心血管系统重要受体具有独立的药理学作用和新的偏倚配体开发潜力，但总体而言配体偏倚新药研究的成功案例非常少，可供参考的研究资料极为有限。其中的一个难点就在于缺乏区别内源性配体偏倚、特定条件下的功能选择性或者不同研究体系之间功能差异的简便判断标准。从功能选择性的角度，对偏倚配体基础研究的吸引力在于检测激动剂是否可以通过开发偏倚配体而“拯救”用于新药研究的受体靶点。GPCR偏倚配体研究，尤其是对那些具有实际临床意义但不良反应明显的“问题”配体将具有重要的实用价值[30]。

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2016-02-22）

（本文编辑：马雯娜）

国家自然科学基金面上项目（81470518，81170092）

200433 上海，第二军医大学长海医院心内科（陈挺、郑兴）；中国药科大学信息管理与信息系（张雪）；温州医学院附属第三医院ICU（翁海旭）；第二军医大学海军医学系（马超群、肖良）

肖良，E-mail：hormat830713@hotmail.com